Choroid Plexus Dysfunksjon ved nevrologiske sykdommer (PLEXFOLD)

Cerebral folatmangel (CFD) er en tilstand definert av lav konsentrasjon (<41 nM) av 5-metyltetrahydrofolat (5MTHF, den biologisk aktive formen av folat) i cerebrospinalvæsken (CSF) 1. CFD anses å være av "primær" opprinnelse hvis det er assosiert med flere genetiske sykdommer som involverer folatmetabolisme, noe som fører til alvorlige motoriske og kognitive manifestasjoner. CFD kan også være "sekundær", dvs. assosiert med ulike bestemte sykdommer som genetiske mitokondrielle sykdommer og også uidentifiserte sykdommer. Ved sekundær CFD er ikke årsaken til CFD forstått. I sentrum identifiserte teamet 16 CFD-pasienter med vanlige kjennetegn: dyp sekundær CFD (5MTHF<10nM mens folat i blodet er normalt), høyprotein-CSF >1g/L (N<0,5) og en spesifikk involvering av hjernehvit substans, hyperintens på T2-vektet MR. Teamet kalte dette syndromet "LHIPFOLD" for leukoencefalopati med CSF HIgh Protein and FOLate Deficiency (konfidensielt, planlagt innsending i slutten av 2022). Innenfor det franske nettverket av laboratorier for metabolsk biokjemi identifiserte teamet 6 ekstra LHIPFOLDpat (LHIPFOLD-pasienter). De har en gjennomsnittsalder på 42 til 14 år (min 15; maks 77), og et kjønnsforhold på 1,8 (M/F). 9/22 hadde enten en stor mitokondriell DNA-sletting (Kearns-Sayre) eller bi-alleliske POLG-mutasjoner (mitokondriell DNA-replikasjonsdefekt). De andre 13 pasientene var alle udiagnostisert inntil nylig, men teamet fant i forskningssammenheng og validerte in vitro bialleliske varianter i 4/7 testede pasienter innenfor gener fra MRPS-familien, som koder for underenheter av mitoribosomet.

LHIPFOLD-pasienter har tydeligvis en defekt av intracerebral 5MTHF-transport, men uten mutasjon av hjernens folattransportører. Siden folat utelukkende transporteres fra blod til hjernen av choroid plexus (CP)2, antar teamet at CFD i LHIPFOLD skyldes CP-dysfunksjon. CP, lokalisert i hjerneventriklene, er et vaskularisert epitelorgan som fungerer som en blod-CSF-barriere, og uttrykker mange transportører for molekyloverføring fra blodet til CSF og omvendt (fjerner avfallsprodukter fra hjerneceller). CP utskiller også CSF og uttrykker CSF-utskilte proteiner relatert til forskjellige funksjoner3.

CSF med høyt proteininnhold på grunn av endring i blod-hjernebarriere, og rapportert unormal CP-morfologi fra hjerneobduksjon hos to Kearns-Sayre-pasienter er også for CP-dysfunksjon i LHIPFOLD 4. I tillegg, i to LHIPFOLDpat, fant teamet svært høye konsentrasjoner av CSF-sialinsyre uten involvering av sialinsyrerelaterte gener, mens CP sterkt uttrykker sialinsyreutstrømningstransportøren. Teamet målte også nylig sterkt redusert CP-størrelse etter automatisk segmentering i to andre LHIPFOLD-pat. Alle disse dataene argumenterer sterkt for CP-dysfunksjon i LHIPFOLD.

Hvis hypotesen er riktig, betyr det at utover CFD, eksisterer sannsynligvis andre CSF-avvik som følge av generalisert CP-dysfunksjon. Dette kan være svært interessant med tanke på terapeutisk tilnærming, da folattilskudd har en klar, men begrenset terapeutisk effekt, spesielt hos noen pasienter. Dessverre, for å vurdere hypotesen vår, er det ingen tilgjengelig klinisk utforskning for å evaluere CP-funksjoner, mens CP-dysfunksjon/endring foreslås som en potensiell patogenesebidragsyter i flere vanlige nevrologiske sykdommer (for følgende tekst vil teamet bruke dysfunksjon for både dysfunksjon og endring ). Siden teamet mener at CP-dysfunksjonen i LHIPFOLD er spesielt alvorlig, som antydet av dyp CFD, anser teamet LHIPFOLD-syndrom som en svært nyttig klinisk modell for å validere kapasiteten til noen relevante diagnostiske verktøy for å evaluere CP-funksjonen. Derfor er målene for prosjektet:

1. Bevis CP-dysfunksjon i LHIPFOLD, gjennom identifisering av spesifikke og CP-relaterte MR og biokjemiske signaturer, ved å bruke CP-sentrert bildebehandling og metabolomikk og proteomikk-tilnærminger.
2. Identifiser CP-relaterte biokjemiske biomarkører i LHIPFOLD som er direkte mottagelig for behandling.
3. Oppsett av bildediagnostikk og biokjemiske diagnostiske tester for evaluering av CP-funksjon i klinisk praksis (biomarkørbasert CP-dysfunksjonsscore).

Metodikk For å nå målene vil teamet gjennomføre en monosentrisk diagnostisk fase 1 case-control studie, basert på beskrivende, deterministisk statistisk og multidimensjonal klyngetilnærming, støttet av komplementære diagnostiske verktøy spesielt utviklet for CP-utforskning av LHIPFOLDpat versus friske frivillige (HV) og nevrologiske kontrollpasienter (NCpat). NCpat vil bli brukt til å vurdere spesifisiteten til de CP-relaterte signaturene identifisert i LHIPFOLDpat. Teamet forventer at funnene vil ligne HV i noen NCpat, men vil reflektere lett til moderat CP-dysfunksjon hos andre. Med AP-HP som studiesponsor vil teamet få godkjenning fra Forskningsetisk komité for en "Jardé 1"-studie, i samsvar med gjeldende lover og forskriftskrav.

- Pasienter og kontrollerer utvelgelse og rekruttering. Emner vil bli rekruttert prospektivt i løpet av en toårsperiode: 1)LHIPFOLDpat vil bli valgt som tidligere beskrevet; 2)HV vil bli rekruttert etter den vanlige reklameprosedyren, og vil bli matchet for alder og kjønn med LHIPFOLDpat; 3) NCpat vil være alders- og kjønnstilpassede pasienter med klare vanlige hjernesykdommer som ofte utforskes i nevrologisk avdeling: multippel sklerose, amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sykdom, frontotemporal demens, idiopatisk intrakraniell hypertensjon og hydrocephalus ved normalt trykk. Diagnosen av disse sykdommene vil bli stilt i henhold til de nyeste retningslinjene av nevrologene som er spesialiserte på hver sykdom. Når det gjelder prøven som skal rekrutteres, tok teamet hensyn til to begrensninger: antallet LHIPFOLDpat er begrenset; studien er ikke en enkel deterministisk sammenligning vs en kontrollgruppe, men mer en flerdimensjonal analyse som fører til identifisering av CP-relaterte signaturer gjennom homogene pasientklynger. Følgelig var strategien å identifisere en global prøvestørrelse som ville føre til en homogen klassifisering av pasienter basert på 5 eller 6 biomarkører. I henhold til Donicars formel5 skal 2^6 pasienter som er riktig valgt ved en stratifisert prøvetakingsteknikk tillate dette. Disse 64 pasientene vil inkludere 15 LHIPFOLDpat og et likt antall på 25 HV og 25 NCpat. Videre, ved å beholde den deterministiske tilnærmingen, og basert på en simuleringsstudie som integrerer gjennomsnitt og standardavvik av CSF 5MTHF i LHIPFOLDpat og NCpat (henholdsvis 3,85 +/- 2,67 og 49,53 +/- 13,35) med henholdsvis 15 og 25 forsøkspersoner, gir denne prøvestørrelsen en kraft større enn 95 % for å demonstrere en forskjell med en Wilcoxon Rank Sum-test mellom disse to gruppene (bemerk at verdier i HV er foreløpig ukjent).

Teamet vil skaffe hjerne-MR-data (med blodgadoliniuminjeksjon), blod- og CSF-prøver fra alle forsøkspersoner. LHIPFOLDpat og NCpat vil gjennomgå disse prosedyrene som en del av standardbehandling ved nevrologisk avdeling ved Pitié-Salpêtrière Hospital. HV vil være innlagt en dag i vårt kliniske undersøkelsessenter. Alle forsøkspersoner vil signere informert samtykke og godta å gjennomgå MR-undersøkelse og blod- og CSF-prøvetaking for forskningsformål for HV, og ytterligere MR-tidsinnsamling og prøvevolum for pasienter.

• Hjerne-MR-studie Hjerne-MR vil bli utført ved 3 TESLA (Siemens PRISMA) ved Centre for Neuroimaging Research (CENIR), bildebehandlingsplattformen til Paris Brain Institute (ICM). Teamet vil vurdere både CP-morfologi og funksjon: 1/For CP-morfologisk analyse vil teamet måle CP-volumer og trekke ut teksturparametere. CP-segmentering vil bli utført ved hjelp av automatisert programvare utviklet på stedet. Teksturanalyse vil bli utført ved å bruke MP2RAGE MR-sekvensen. 2/CP funksjonsvurdering vil inkludere kvantitative målinger av kapillær permeabilitet og makrovaskulær perfusjon. For å utforske CP-permeabilitet, vil dynamisk T1-perfusjonssekvens med gadoliniumforsterkning bli brukt; t-TRANS og andre regionale verdier vil bli hentet ut. Etterbehandling vil bli utført med programvaren Syngovia (Siemens). For å utforske CP makrovaskulær perfusjon, vil teamet bruke en kortere versjon av den dynamiske Arterial Spin Labeling perfusjonen (uten gadolinium) publisert tidligere 6. Med denne sekvensen vil teamet være i stand til å sette pris på arteriell transittid og tilsynelatende blodstrøm. Dataanalyse vil bli utført ved CENIR.
• Oppdagelse av CP-dysfunksjon biomarkørkandidater i CSF/blodrom To blandede tilnærminger vil bli brukt for å velge de 10 beste biomarkørkandidatene (a priori 5 metabolitter og 5 proteiner) som vil bli undersøkt med en målrettet og fullstendig kvantitativ analyse: i) umålrettet metabolomikk og proteomikk (funnene vil bli gjennomgått for å vurdere en mulig sammenheng med CP-funksjon); og ii) hypotesedrevet tilnærming: i tillegg til 5MTHF, basert på data fra litteraturen og offentlig tilgjengelig biologisk database, identifiserte teamet også metabolitter (inkludert askorbinsyre og sialinsyre) som ser ut til å bli spesifikt transportert av CP, og proteiner spesifikt uttrykt av CP (inkludert TRPM3 og Klotho). Siden blodkonsentrasjoner kan påvirke CSF-konsentrasjoner for noen molekyler, planlegger teamet å analysere blod og CSF-prøver samtidig, med beregning av et CSF/Blod-forhold av konsentrasjoner.

For ikke-målrettet metabolomikk vil metabolske ekstrakter av CSF og plasmaprøver bli oppnådd etter metanolassistert proteinutfelling og analysert ved væskekromatografi koblet til høyoppløselig massespektrometri (LC-HRMS) mens teamet rutinemessig utfører 7. En kombinasjon av to komplementære LC- HRMS-plattformer vil bli brukt til å profilere både hydrofobe og polare metabolitter8. Dataforbehandling og statistiske analyser vil bli oppnådd ved å bruke Workflow4Metabolomics (W4M), som er en åpen kildekode-samarbeidsplattform for beregningsmetabolomikk. Annotering av datasett og identifisering av biologisk relevante signaler vil bli utført ved bruk av "in-house" spektralbiblioteker, og MS/MS (tandem massespektrometri) eksperimenter. Relativ kvantifisering av ~250 metabolitter vil bli oppnådd takket være normalisering ved bruk av kvalitetskontrollprøver. For målrettet metabolomikk måles CSF 5MTHF rutinemessig i Necker-laboratoriet spesialisert på nevrometabolisme, ved bruk av svært sensitive og spesifikke analytiske metoder (væskekromatografi bindestrek til tandem-MS). Teamet er i ferd med å inkludere askorbinsyre- og sialinsyretiltak i samme kjøring. Avhengig av den kjemiske naturen til metabolittbiomarkørkandidatene identifisert i den ikke-målrettede studien, vil en eller få nye metoder for robust kvantifisering ved bruk av stabile isotoper bli utviklet.

En foreløpig proteomisk studie på CSF til en pasient med høyt CSF-protein og en kontroll vil tillate oss å etablere en prøveforberedelsesprotokoll, velge en massespektrometrianalysemetode og dataanalysearbeidsflyt. Målet er todelt: å optimalisere utvinningen av proteiner og å tillate sammenligning av svært forskjellige CSFer for å utvikle en analytisk strategi som vil tillate oss å identifisere biomarkører. Studien vil bli utført ved å bruke en etikettfri tilnærming for å minimere variasjon, antall trinn og spesielt ikke for å begrense prøvens dynamiske rekkevidde. Alle bioinformatikkanalyser vil bli utført med myProMS9, vår proteomiske databehandlings- og analyseprogramvare utviklet ved Institut Curie i samarbeid med INSERM U900 bioinformatikkplattformen ledet av Dr E. Barillot. For den målrettede proteomiske tilnærmingen vil teamet bruke ekspertisen på målrettet MS med stabile isotopmerkede interne standardpeptider, gullstandardtilnærmingen for proteinkvantifisering i biologisk væske, noe som resulterer i høy robusthet, høy sensitivitet og multipleksanalyse10.

- Kryssdataanalyse Teamet vil sentralt administrere, analysere og integrere kliniske og biologiske datasett og kunnskap generert av MR og biologiske prøveanalyser for å identifisere en global CP-relatert signatur hos LHIPFOLD-pasienter. Med disse dataene vil teamet etablere en CP-dysfunksjonsscore for bruk i rutinemessig klinisk praksis, beregnet på å brukes til å utforske CP hos nevrologiske pasienter.