Suonikalvon plexuksen toimintahäiriö neurologisissa sairauksissa (PLEXFOLD)

Aivofolaattipuutos (CFD) on tila, jossa 5-metyylitetrahydrofolaatin (5MTHF, folaatin biologisesti aktiivinen muoto) pitoisuus on alhainen (<41 nM) aivo-selkäydinnesteessä (CSF) 1. CFD:n katsotaan olevan "ensisijainen" alkuperä, jos se liittyy useisiin geneettisiin sairauksiin, joihin liittyy folaattiaineenvaihduntaa, mikä johtaa vakaviin motorisiin ja kognitiivisiin ilmenemismuotoihin. CFD voi olla myös "toissijainen", eli se liittyy useisiin tiettyihin sairauksiin, kuten geneettisiin mitokondriosairauksiin ja myös tunnistamattomiin sairauksiin. Toissijaisessa CFD:ssä CFD:n syytä ei ymmärretä. Keskuksessa ryhmä tunnisti 16 CFD-potilasta, joilla oli yhteisiä piirteitä: syvä sekundaarinen CFD (5MTHF < 10 nM, kun taas veren folaatti on normaali), korkeaproteiininen CSF > 1 g/l (N < 0,5) ja spesifinen aivojen valkoisen aineen osallisuus. hyperintensiivinen T2-painotetussa magneettikuvauksessa. Ryhmä kutsui tätä oireyhtymää "LHIPFOLD" leukoenkefalopatiaan, johon liittyy korkea CSF:n proteiini- ja folaattipuutos (luottamuksellinen, suunniteltu toimittaminen vuoden 2022 lopussa). Ranskan metabolisen biokemian laboratorioiden verkostossa ryhmä tunnisti kuusi muuta LHIPFOLDpat-potilasta (LHIPFOLD-potilasta). Heidän keski-ikä on 42–14 vuotta (min 15; maksimi 77) ja sukupuolisuhde 1,8 (M/F). 9/22:lla oli joko suuri mitokondriaalinen DNA-deleetio (Kearns-Sayre) tai kaksialleeliset POLG-mutaatiot (mitokondrion DNA:n replikaatiovika). Muut 13 potilasta olivat kaikki diagnosoimattomia viime aikoihin asti, mutta ryhmä löysi tutkimuskontekstissa ja validoi in vitro bi-alleelisia variantteja 4/7 testatusta potilaasta MRPS-perheen geeneissä, jotka koodaavat mitoribosomin alayksiköitä.

LHIPFOLD-potilailla on selkeästi aivojen sisäisen 5MTHF-kuljetuksen puute, mutta ilman aivojen folaattikuljettajien mutaatiota. Koska folaatti kuljetetaan verestä aivoihin yksinomaan suonipunoksen (CP)2 avulla, ryhmä olettaa, että LHIPFOLDin CFD johtuu CP-häiriöstä. CP, joka sijaitsee aivojen kammioissa, on verisuonittunut epiteelielin, joka toimii veri-CSF-esteenä ja ekspressoi lukuisia kuljettajia molekyyleille, jotka siirtyvät verestä CSF:ään ja päinvastoin (poistavat kuona-aineita aivosoluista). CP erittää myös CSF:ää ja ekspressoi CSF:n erittämiä proteiineja, jotka liittyvät eri toimintoihin3.

Veri-aivoesteen muutoksesta johtuva korkea proteiinipitoisuus CSF ja raportoitu epänormaali CP-morfologia aivojen ruumiinavauksessa kahdella Kearns-Sayre-potilaalla puoltavat myös CP-häiriötä LHIPFOLD 4:ssä. Lisäksi ryhmä havaitsi kahdessa LHIPFOLDpatissa erittäin korkeita pitoisuuksia CSF-sialihappo ilman siaalihappoon liittyvien geenien osallistumista, kun taas CP ekspressoi voimakkaasti siaalihapon ulosvirtauskuljettajaa. Tiimi myös mittasi äskettäin voimakkaasti pienentyneen CP-koon automaattisen segmentoinnin jälkeen kahdessa muussa LHIPFOLD-patissa. Kaikki nämä tiedot tukevat vahvasti CP:n toimintahäiriötä LHIPFOLDissa.

Jos hypoteesi on oikea, se tarkoittaa, että CFD:n lisäksi muita CSF-poikkeavuuksia todennäköisesti esiintyy yleistyneen CP-häiriön seurauksena. Tämä voi olla erittäin mielenkiintoista terapeuttisen lähestymistavan kannalta, koska folaattilisällä on selkeä mutta rajoitettu terapeuttinen vaikutus, erityisesti joillakin potilailla. Valitettavasti hypoteesimme arvioimiseksi ei ole saatavilla kliinistä tutkimusta CP-toimintojen arvioimiseksi, kun taas CP:n toimintahäiriötä/muutosta ehdotetaan mahdolliseksi patogeneesin tekijäksi useissa yleisissä neurologisissa sairauksissa (seuraavassa tekstissä tiimi käyttää toimintahäiriötä sekä toimintahäiriön että muutoksen yhteydessä ). Koska ryhmä uskoo, että LHIPFOLDissa CP-häiriö on erityisen vakava, kuten syvä CFD ehdottaa, ryhmä pitää LHIPFOLD-oireyhtymää erittäin hyödyllisenä kliinisenä mallina validoidakseen joidenkin asiaankuuluvien diagnostisten työkalujen kyvyn arvioida CP:n toimintaa. Siksi hankkeen tavoitteet ovat:

1. Todista CP:n toimintahäiriö LHIPFOLDissa tunnistamalla spesifiset ja CP:hen liittyvät MRI- ja biokemialliset allekirjoitukset käyttämällä CP-keskeistä kuvantamista sekä metabolomiikan ja proteomiikan lähestymistapoja.
2. Tunnista CP:hen liittyvät biokemialliset biomarkkerit LHIPFOLDista, jotka ovat suoraan hoidettavissa.
3. Kokoonpanokuvantaminen ja biokemialliset diagnostiset testit CP-toiminnan arvioimiseksi kliinisessä käytännössä (biomarkkereihin perustuva CP-dysfunction score).

Metodologia Tavoitteiden saavuttamiseksi tiimi suorittaa yksikeskisen diagnostisen vaiheen 1 tapauskontrollitutkimuksen, joka perustuu kuvaavaan, deterministiseen tilastolliseen ja moniulotteiseen klusterointiin ja jota tukevat täydentävät diagnostiset työkalut, jotka on erityisesti suunniteltu LHIPFOLDpatin ja terveiden vapaaehtoisten (HV) CP-tutkimukseen. neurologiset kontrollipotilaat (NCpat). NCpat:ia käytetään LHIPFOLDpatissa tunnistettujen CP:hen liittyvien allekirjoitusten spesifisyyden arvioimiseen. Ryhmä odottaa, että löydökset ovat samanlaisia ​​kuin HV joissakin NCpatissa, mutta heijastavat lievää tai kohtalaista CP-häiriötä toisissa. Kun AP-HP on tutkimuksen rahoittaja, tiimi saa tutkimuseettiseltä komitealta hyväksynnän "Jardé 1" -tutkimukselle voimassa olevan lainsäädännön ja säännösten mukaisesti.

-Potilaiden ja kontrollien valinta ja rekrytointi Koehenkilöt rekrytoidaan tulevina vuosina kahden vuoden aikana: 1)LHIPFOLDpat valitaan edellä kuvatulla tavalla; 2)HV rekrytoidaan tavanomaisella ilmoitusmenettelyllä, ja se sovitetaan iän ja sukupuolen mukaan LHIPFOLDpatilla; 3) NCpat on ikään ja sukupuoleen sopivat potilaat, joilla on tietyt yleiset aivosairaudet, joita tutkitaan usein neurologisella osastolla: multippeliskleroosi, amyotrofinen lateraaliskleroosi, alzheimerin tauti, frontotemporaalinen dementia, idiopaattinen kallonsisäinen hypertensio ja normaalipaineinen vesipää. Näiden sairauksien diagnoosin tekevät kuhunkin sairauteen erikoistuneet neurologit uusimpien ohjeiden mukaan. Rekrytoitavan otoksen osalta työryhmä otti huomioon kaksi rajoitusta: LHIPFOLDpattien lukumäärä on rajoitettu; Tutkimus ei ole yksinkertainen deterministinen vertailu verrokkiryhmään, vaan pikemminkin moniulotteinen analyysi, joka johtaa CP:hen liittyvien allekirjoitusten tunnistamiseen homogeenisten potilasklustereiden kautta. Tästä syystä strategiana oli tunnistaa globaali otoskoko, joka johtaisi homogeeniseen potilaiden luokitukseen 5 tai 6 biomarkkerin perusteella. Donicarin kaavan5 mukaan 2^6 potilasta, jotka on valittu oikein kerrostetulla näytteenottotekniikalla, pitäisi sallia tämä. Näihin 64 potilaaseen kuuluu 15 LHIPFOLDpatia ja yhtä paljon 25 HV- ja 25 NCpat-potilaita. Lisäksi noudattaen determinististä lähestymistapaa ja perustuen simulaatiotutkimukseen, joka integroi CSF 5MTHF:n keskiarvon ja keskihajonnan LHIPFOLDpatissa ja NCpatissa (3,85 +/- 2,67 ja 49,53 +/- 13,35) vastaavasti 15 ja 25 koehenkilöllä. yli 95 %:n teho osoittaakseen eron Wilcoxon Rank Sum -testillä näiden kahden ryhmän välillä (huomaa, että HV-arvoja ei tällä hetkellä tunneta).

Tiimi hankkii kaikilta koehenkilöiltä aivojen MRI-tiedot (veren gadolinium-injektiolla), veri- ja aivo-selkäydinnestenäytteet. LHIPFOLDpat ja NCpat käyvät läpi nämä toimenpiteet osana normaalia hoitoa Pitié-Salpêtrièren sairaalan neurologisessa osastossa. HV joutuu sairaalahoitoon jonakin päivänä kliinisessä tutkimuskeskuksessamme. Kaikki koehenkilöt allekirjoittavat tietoisen suostumuksensa ja suostuvat menemään MRI-tutkimukseen ja veri- ja aivo-selkäydinnesteen näytteenottoon HV:n tutkimusta varten sekä ylimääräisen MRI-ajan ja näytemäärien ottamista potilaille.

• Aivojen MRI-tutkimus Aivojen MRI suoritetaan 3 TESLA:ssa (Siemens PRISMA) Centre for Neuroimaging Researchissa (CENIR), Pariisin aivoinstituutin (ICM) kuvantamisalustalla. Ryhmä arvioi sekä CP:n morfologian että toiminnan: 1/CP:n morfologisessa analyysissä tiimi mittaa CP-tilavuuksia ja poimii tekstuuriparametreja. CP-segmentointi suoritetaan paikalla kehitetyllä automatisoidulla ohjelmistolla. Tekstuurianalyysi suoritetaan käyttämällä MP2RAGE MRI -sekvenssiä. 2/CP-toiminnan arviointi sisältää kapillaarien läpäisevyyden ja makrovaskulaarisen perfuusion kvantitatiiviset mittaukset. CP:n läpäisevyyden tutkimiseksi käytetään dynaamista T1-perfuusiosekvenssiä, jossa on gadoliinin tehostaminen; t-TRANS ja muut alueelliset arvot otetaan talteen. Jälkikäsittely suoritetaan Syngovia (Siemens) -ohjelmistolla. Tutkiakseen CP-makrovaskulaarista perfuusiota tiimi käyttää lyhyempää versiota dynaamisesta valtimoiden spin-merkintäperfuusista (ilman gadoliinia), joka on julkaistu aiemmin 6. Tämän sekvenssin avulla tiimi pystyy arvioimaan valtimoiden kulkuaikaa ja näennäistä verenkiertoa. Tietojen analysointi suoritetaan CENIRissä.
• CP:n toimintahäiriön biomarkkeriehdokkaiden löytäminen aivo-selkäydinnesteessä/veriosastoissa Kahta sekalaista lähestymistapaa käytetään valittaessa 10 parasta biomarkkerikandidaattia (ennakolta 5 metaboliittia ja 5 proteiinia), jotka tutkitaan kohdistetulla ja täysin kvantitatiivisella analyysillä: i) Kohdistamaton metabolomiikka ja proteomiikka (löydöksiä tarkastellaan, jotta voidaan arvioida mahdollinen yhteys CP-toimintoon); ja ii) hypoteesilähtöinen lähestymistapa: 5MTHF:n lisäksi kirjallisuuden ja julkisesti saatavilla olevan biologisen tietokannan tietojen perusteella ryhmä tunnisti myös metaboliitteja (mukaan lukien askorbiinihappo ja siaalihappo), joita CP näyttää kuljettavan spesifisesti, ja proteiineja CP (mukaan lukien TRPM3 ja Klotho). Koska veripitoisuudet voivat vaikuttaa joidenkin molekyylien aivo-selkäydinnesteen pitoisuuksiin, tiimi suunnittelee analysoivansa verta ja aivo-selkäydinnestettä samanaikaisesti ja laskemalla pitoisuuksien CSF/veri-suhteen.

Kohdistamatonta metabolomiikkaa varten CSF- ja plasmanäytteiden metaboliset uutteet saadaan metanoliavusteisen proteiinisaostuksen jälkeen ja analysoidaan nestekromatografialla yhdistettynä korkearesoluutioiseen massaspektrometriaan (LC-HRMS), kun ryhmä suorittaa rutiininomaisesti 7. Kahden toisiaan täydentävän LC- HRMS-alustoja käytetään sekä hydrofobisten että polaaristen metaboliittien profilointiin8. Tietojen esikäsittely ja tilastolliset analyysit toteutetaan Workflow4Metabolomicsilla (W4M), joka on avoimen lähdekoodin yhteistoiminnallinen verkkoalusta laskennalliseen metabolomiikkaan. Tietokokonaisuuksien merkitseminen ja biologisesti merkityksellisten signaalien tunnistaminen suoritetaan käyttämällä "sisäisiä" spektrikirjastoja ja MS/MS (tandem massaspektrometria) -kokeita. ~250 metaboliitin suhteellinen kvantifiointi saavutetaan laadunvalvontanäytteitä käyttävän normalisoinnin ansiosta. Kohdennettua metabolomiikkaa varten CSF 5MTHF mitataan rutiininomaisesti neurometabolismiin erikoistuneessa Necker-laboratoriossa käyttämällä erittäin herkkiä ja spesifisiä analyyttisiä menetelmiä (nestekromatografia tavoitettuna tandem MS:ksi). Tiimi aikoo sisällyttää samaan ajoon askorbiinihappo- ja siaalihappotoimenpiteitä. Kohduttamattomassa tutkimuksessa tunnistettujen metaboliittien biomarkkeriehdokkaiden kemiallisesta luonteesta riippuen kehitetään yksi tai muutama uusi menetelmä vakaaseen kvantifiointiin käyttämällä stabiileja isotooppeja.

Alustava proteominen tutkimus potilaan aivo-selkäydinnesteestä, jolla on korkea CSF-proteiini ja kontrolli, mahdollistaa näytteenvalmistusprotokollan, massaspektrometrian analyysimenetelmän valitsemisen ja data-analyysin työnkulun. Tavoitteena on kaksiosainen: optimoida proteiinien uuttaminen ja mahdollistaa hyvin erilaisten CSF:ien vertailu, jotta voimme kehittää analyyttisen strategian, jonka avulla voimme tunnistaa biomarkkereita. Tutkimus toteutetaan käyttämällä leimatonta lähestymistapaa vaihtelevuuden, vaiheiden määrän minimoimiseksi ja varsinkin näytteen dynaamisen alueen rajoittamiseksi. Kaikki bioinformatiikan analyysit suoritetaan myProMS9:llä, proteomisen tiedonhallinta- ja analyysiohjelmistollamme, joka on kehitetty Institut Curiessa yhteistyössä tohtori E. Barillotin johtaman INSERM U900 -bioinformatiikkaalustan kanssa. Kohdennettua proteomista lähestymistapaa varten tiimi käyttää asiantuntemusta kohdennetusta MS:stä stabiilien isotooppileimattujen sisäisten standardipeptidien kanssa, kultaisen standardin lähestymistapaa proteiinien kvantifiointiin biologisessa nesteessä, mikä johtaa korkeaan kestävyyteen, korkeaan herkkyyteen ja multipleksianalyysiin10.

-Ristitietojen analyysi Tiimi hallitsee, analysoi ja integroi keskitetysti kliinisiä ja biologisia tietokokonaisuuksia ja MRI- ja biologisten näytteiden analyysin tuottamaa tietoa tunnistaakseen maailmanlaajuisen CP:hen liittyvän allekirjoituksen LHIPFOLD-potilailla. Näillä tiedoilla tiimi määrittää CP-häiriöpisteet rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä käytettäväksi neurologisten potilaiden CP-tutkimuksessa.