Dysfunkce choroidálního plexu u neurologických onemocnění (PLEXFOLD)

Cerebrální nedostatek folátu (CFD) je stav definovaný nízkou koncentrací (<41 nM) 5-methyltetrahydrofolátu (5MTHF, biologicky aktivní forma folátu) v mozkomíšním moku (CSF) 1. CFD je považován za „primární“ původu, pokud je spojena s několika genetickými onemocněními zahrnujícími metabolismus folátu, což vede k závažným motorickým a kognitivním projevům. CFD může být také „sekundární“, tj. související s různými určitými chorobami, jako jsou genetická mitochondriální onemocnění a také neidentifikovaná onemocnění. U sekundárního CFD není příčina CFD pochopena. V centru tým identifikoval 16 pacientů s CFD se společnými charakteristikami: hlubokou sekundární CFD (5MTHF<10nM, zatímco krevní folát je normální), CSF s vysokým obsahem bílkovin >1g/l (N<0,5) a specifické postižení bílé hmoty mozku, hyperintenzivní na T2-vážené MRI. Tým nazval tento syndrom „LHIPFOLD“ pro leukoencefalopatii s vysokým obsahem bílkovin a deficitu FOLate v CSF (důvěrné, plánované předložení na konec roku 2022). V rámci sítě francouzských laboratoří metabolické biochemie tým identifikoval 6 dalších LHIPFOLDpat (pacienti LHIPFOLD). Mají průměrný věk 42 až 14 let (min 15; max. 77) a poměr pohlaví 1,8 (M/F). 9/22 měl buď velkou mitochondriální deleci DNA (Kearns-Sayre) nebo bialelické POLG mutace (defekt replikace mitochondriální DNA). Ostatních 13 pacientů nebylo donedávna diagnostikováno, ale tým našel v kontextu výzkumu a potvrdil in vitro bialelické varianty u 4/7 testovaných pacientů v rámci genů z rodiny MRPS, kódujících podjednotky mitoribozomu.

Pacienti s LHIPFOLD mají jasně defekt intracerebrálního transportu 5MTHF, ale bez mutace mozkových folátových transportérů. Vzhledem k tomu, že folát je výlučně transportován z krve do mozku choroidálním plexem (CP)2, tým předpokládá, že CFD v LHIPFOLD je způsobena dysfunkcí CP. CP, lokalizovaný v mozkových komorách, je vaskularizovaný epiteliální orgán, který působí jako bariéra krev-CSF, exprimující četné transportéry pro přenos molekul z krve do CSF ​​a naopak (odstranění odpadních produktů z mozkových buněk). CP také vylučuje CSF a exprimuje proteiny vylučované CSF související s různými funkcemi3.

CSF s vysokým obsahem bílkovin v důsledku změny hematoencefalické bariéry a hlášená abnormální morfologie CP z pitvy mozku u dvou pacientů Kearns-Sayre jsou také ve prospěch dysfunkce CP v LHIPFOLD 4. Kromě toho u dvou LHIPFOLDpat tým zjistil velmi vysoké koncentrace CSF kyselina sialová bez účasti genů souvisejících s kyselinou sialovou, zatímco CP silně exprimuje efluxní transportér kyseliny sialové. Tým také nedávno změřil silně sníženou velikost CP po automatické segmentaci u dvou dalších pat LHIPFOLD. Všechny tyto údaje silně hovoří pro dysfunkci CP u LHIPFOLD.

Pokud je hypotéza správná, znamená to, že kromě CFD pravděpodobně existují další abnormality CSF jako důsledek generalizované dysfunkce CP. To může být velmi zajímavé z hlediska terapeutického přístupu, protože suplementace folátem má jasný, ale omezený terapeutický efekt, zejména u některých pacientů. Bohužel pro posouzení naší hypotézy není k dispozici žádný klinický průzkum pro hodnocení funkcí CP, zatímco dysfunkce/změna CP je navržena jako potenciální přispěvatel k patogenezi u několika běžných neurologických onemocnění (pro následující text bude tým používat dysfunkci jak pro dysfunkci, tak pro změnu ). Protože se tým domnívá, že u LHIPFOLD je dysfunkce CP obzvláště závažná, jak naznačuje hluboká CFD, tým považuje syndrom LHIPFOLD za velmi užitečný klinický model k ověření kapacity některých relevantních diagnostických nástrojů k hodnocení funkce CP. Proto jsou cíle projektu:

1. Prokažte dysfunkci CP v LHIPFOLD pomocí identifikace specifických a s CP souvisejících MRI a biochemických signatur, pomocí CP-centrovaného zobrazování a metabolomických a proteomických přístupů.
2. Identifikujte biochemické biomarkery související s CP v LHIPFOLD přímo přístupné léčbě.
3. Nastavení zobrazovacích a biochemických diagnostických testů pro hodnocení funkce CP v klinické praxi (skóre CP dysfunkce založené na biomarkerech).

Metodologie Aby tým dosáhl cílů, provede monocentrickou diagnostickou studii fáze 1 případ-kontrolu, založenou na deskriptivním, deterministickém statistickém a multidimenzionálním shlukovacím přístupu, podporovanou doplňkovými diagnostickými nástroji speciálně navrženými pro CP průzkum LHIPFOLDpat oproti zdravým dobrovolníkům (HV) a pacienti s neurologickou kontrolou (NCpat). NCpat se použije k posouzení specifičnosti signatur souvisejících s CP identifikovaných v LHIPFOLDpat. Tým očekává, že nálezy budou u některých NCpat podobné jako u HV, ale u jiných budou odrážet mírnou až střední dysfunkci CP. S AP-HP jako sponzorem studie získá tým souhlas Etického výboru pro výzkum pro studii „Jardé 1“ v souladu s platnou legislativou a regulačními požadavky.

-Výběr a nábor pacientů a kontrol Subjekty budou prospektivně přijímány během dvouletého období: 1)LHIPFOLDpat bude vybrán, jak bylo popsáno výše; 2)HV bude rekrutován obvyklým inzertním postupem a bude přiřazen podle věku a pohlaví pomocí LHIPFOLDpat; 3) NCpat budou pacienti odpovídající věku a pohlaví s určitými běžnými onemocněními mozku často zkoumanými na neurologickém oddělení: roztroušená skleróza, amyotrofická laterální skleróza, alzheimerova choroba, frontotemporální demence, idiopatická intrakraniální hypertenze a hydrocefalus normálního tlaku. Diagnózu těchto onemocnění budou provádět podle nejnovějších směrnic neurologové specializovaní na každé onemocnění. Pokud jde o vzorek, který má být přijat, tým vzal v úvahu dvě omezení: počet LHIPFOLDpat je omezený; studie není jednoduchým deterministickým srovnáním s kontrolní skupinou, ale spíše vícerozměrnou analýzou vedoucí k identifikaci signatur souvisejících s CP prostřednictvím homogenních shluků pacientů. V důsledku toho bylo strategií identifikovat globální velikost vzorku, která by vedla k homogenní klasifikaci pacientů na základě 5 nebo 6 biomarkerů. Podle Donicarova vzorce5 by to mělo umožňovat 2^6 pacientů správně vybraných technikou stratifikovaného odběru vzorků. Těchto 64 pacientů bude zahrnovat 15 LHIPFOLDpat a stejný počet 25 HV a 25 NCpat. Kromě toho, při zachování deterministického přístupu a na základě simulační studie integrující průměr a směrodatnou odchylku CSF 5MTHF v LHIPFOLDpat a NCpat (3,85 +/- 2,67 a 49,53 +/- 13,35 v tomto pořadí) u 15 a 25 subjektů poskytuje tato velikost vzorku síla větší než 95 % k prokázání rozdílu s Wilcoxon Rank Sum testem mezi těmito dvěma skupinami (za zmínku, že hodnoty v HV jsou v současnosti neznámé).

Tým získá data MRI mozku (s injekcí gadolinia do krve), vzorky krve a CSF od všech subjektů. LHIPFOLDpat a NCpat podstoupí tyto procedury jako součást standardní péče na neurologickém oddělení nemocnice Pitié-Salpêtrière. HV bude jednoho dne hospitalizována v našem Centru klinického vyšetřování. Všechny subjekty podepíší informovaný souhlas a souhlasí s tím, že podstoupí MRI vyšetření a odběr krve a mozkomíšního moku pro výzkumné účely na HV, a další získávání času MRI a objemů vzorků pro pacienty.

• Studie MRI mozku MRI mozku bude provedeno v 3 TESLA (Siemens PRISMA) v Centru pro výzkum neuroimagingu (CENIR), zobrazovací platformě Paris Brain Institute (ICM). Tým posoudí morfologii i funkci CP: 1/pro morfologickou analýzu CP tým změří objemy CP a extrahuje texturní parametry. Segmentace CP bude prováděna pomocí automatizovaného softwaru vyvinutého na místě. Texturní analýza bude provedena pomocí MP2RAGE MRI sekvence. 2/Vyhodnocení funkce CP bude zahrnovat kvantitativní měření kapilární permeability a makrovaskulární perfuze. K prozkoumání permeability CP bude použita dynamická perfuzní sekvence T1 se zesílením gadolinia; t-TRANS a další regionální hodnoty budou extrahovány. Následné zpracování bude provedeno pomocí softwaru Syngovia (Siemens). K prozkoumání makrovaskulární perfuze CP tým použije kratší verzi dynamické perfuze Arterial Spin Labeling (bez gadolinia) publikované dříve 6. S touto sekvencí bude tým schopen ocenit dobu arteriálního tranzitu a zjevný průtok krve. Analýza dat bude provedena na CENIR.
• Objev kandidátů biomarkerů dysfunkce CP v CSF/krevních kompartmentech K výběru 10 nejlepších kandidátů na biomarkery (a priori 5 metabolitů a 5 proteinů), které budou zkoumány cílenou a plně kvantitativní analýzou, budou použity dva smíšené přístupy: i) necílená metabolomika a proteomika (zjištění budou přezkoumána za účelem posouzení možné souvislosti s funkcí CP); a ii) přístup založený na hypotézách: kromě 5MTHF na základě údajů z literatury a veřejně dostupné biologické databáze tým také identifikoval metabolity (včetně kyseliny askorbové a kyseliny sialové), které se zdají být specificky transportovány CP, a proteiny specificky vyjádřeno CP (včetně TRPM3 a Klotho). Protože koncentrace v mozkomíšním moku může ovlivnit koncentrace některých molekul v CSF, tým plánuje analyzovat krev a vzorky CSF současně s výpočtem poměru koncentrací CSF/Krev.

Pro necílenou metabolomiku budou metabolické extrakty CSF a vzorků plazmy získány po precipitaci proteinů za pomoci methanolu a analyzovány kapalinovou chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (LC-HRMS), protože tým běžně provádí 7. Kombinace dvou komplementárních LC- Platformy HRMS budou použity k profilování hydrofobních i polárních metabolitů8. Předzpracování dat a statistické analýzy bude dosaženo pomocí Workflow4Metabolomics (W4M), což je open source kolaborativní online platforma pro výpočetní metabolomiku. Anotace datových souborů a identifikace biologicky relevantních signálů bude provedena pomocí „interních“ spektrálních knihoven a experimentů MS/MS (tandemová hmotnostní spektrometrie). Relativní kvantifikace ~250 metabolitů bude dosaženo díky normalizaci pomocí vzorků kontroly kvality. Pro cílenou metabolomiku je CSF 5MTHF rutinně měřen v Neckerově laboratoři specializované na neurometabolismus za použití velmi citlivých a specifických analytických metod (kapalinová chromatografie spojená s tandemovou MS). Tým je v procesu začlenění do stejného cyklu měření kyseliny askorbové a kyseliny sialové. V závislosti na chemické povaze kandidátů biomarkerů metabolitů identifikovaných v necílené studii bude vyvinuta jedna nebo několik nových metod pro robustní kvantifikaci pomocí stabilních izotopů.

Předběžná proteomická studie mozkomíšního moku pacienta s vysokým obsahem proteinu CSF a kontrola nám umožní sestavit protokol přípravy vzorku, vybrat metodu analýzy hmotnostní spektrometrií a pracovní postup analýzy dat. Cíl je dvojí: optimalizovat extrakci proteinů a umožnit srovnání velmi rozdílných CSF s cílem vyvinout analytickou strategii, která nám umožní identifikovat biomarkery. Studie bude provedena s použitím přístupu bez značení, aby se minimalizovala variabilita, počet kroků a zejména aby nebyl omezen dynamický rozsah vzorku. Všechny bioinformatické analýzy budou prováděny pomocí myProMS9, našeho softwaru pro správu a analýzu proteomických dat vyvinutého v Institutu Curie ve spolupráci s bioinformatickou platformou INSERM U900 pod vedením Dr. E. Barillota. Pro cílený proteomický přístup tým využije odborných znalostí o cílené RS se stabilními izotopově značenými interními standardními peptidy, což je zlatý standard pro kvantifikaci proteinů v biologické tekutině, jehož výsledkem je vysoká robustnost, vysoká citlivost a multiplexní analýza10.

-Křížová analýza dat Tým bude centrálně spravovat, analyzovat a integrovat klinické a biologické datové soubory a znalosti generované analýzou MRI a biologických vzorků, aby identifikoval globální signaturu související s CP u pacientů s LHIPFOLD. Na základě těchto údajů tým stanoví skóre dysfunkce CP pro použití v běžné klinické praxi, které má být použito k vyšetření CP u neurologických pacientů.