Funktionsstörung des Plexus choroideus bei neurologischen Erkrankungen (PLEXFOLD)

Zerebraler Folatmangel (CFD) ist ein Zustand, der durch eine niedrige Konzentration (<41 nM) von 5-Methyltetrahydrofolat (5MTHF, die biologisch aktive Form von Folat) in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) 1 definiert wird. CFD gilt als „primär“ Ursprung, wenn es mit mehreren genetischen Erkrankungen verbunden ist, die den Folatstoffwechsel betreffen und zu schweren motorischen und kognitiven Manifestationen führen. CFD kann auch „sekundär“ sein, d. h. mit verschiedenen eindeutigen Krankheiten wie genetischen Mitochondrienerkrankungen und auch nicht identifizierten Krankheiten verbunden sein. Beim sekundären CFD ist die Ursache des CFD nicht geklärt. Im Zentrum identifizierte das Team 16 CFD-Patienten mit gemeinsamen Merkmalen: tiefe sekundäre CFD (5 MTHF < 10 nM, während Blutfolat normal ist), hoher Proteingehalt im Liquor > 1 g/l (N < 0,5) und eine spezifische Beteiligung der weißen Substanz des Gehirns. hyperintens im T2-gewichteten MRT. Das Team nannte dieses Syndrom „LHIPFOLD“ für Leukoenzephalopathie mit CSF-HIgh-Protein- und FOLate-Mangel (vertraulich, geplante Einreichung Ende 2022). Innerhalb des französischen Labornetzwerks für metabolische Biochemie identifizierte das Team sechs weitere LHIPFOLDpat (LHIPFOLD-Patienten). Sie haben ein Durchschnittsalter von 42 bis 14 Jahren (mindestens 15; höchstens 77 Jahre) und ein Geschlechterverhältnis von 1,8 (M/F). 9/22 hatten entweder eine große mitochondriale DNA-Deletion (Kearns-Sayre) oder bi-allelische POLG-Mutationen (mitochondrialer DNA-Replikationsdefekt). Die anderen 13 Patienten waren bis vor Kurzem alle nicht diagnostiziert, aber das Team fand in einem Forschungskontext bi-allelische Varianten und validierte sie in vitro bei 4/7 getesteten Patienten innerhalb von Genen aus der MRPS-Familie, die für Untereinheiten des Mitoribosoms kodieren.

Bei LHIPFOLD-Patienten liegt eindeutig ein Defekt des intrazerebralen 5MTHF-Transports vor, jedoch ohne Mutation der Folattransporter im Gehirn. Da Folat ausschließlich über den Plexus choroideus (CP)2 vom Blut zum Gehirn transportiert wird, vermutet das Team, dass CFD bei LHIPFOLD auf eine CP-Dysfunktion zurückzuführen ist. CP, lokalisiert in den Hirnventrikeln, ist ein vaskularisiertes Epithelorgan, das als Blut-Liquor-Barriere fungiert und zahlreiche Transporter für die Übertragung von Molekülen vom Blut in den Liquor und umgekehrt exprimiert (wobei Abfallprodukte aus den Gehirnzellen entfernt werden). CP sezerniert auch CSF und exprimiert CSF-sekretierte Proteine, die mit verschiedenen Funktionen in Zusammenhang stehen3.

Ein hoher Proteingehalt im Liquor aufgrund einer Veränderung der Blut-Hirn-Schranke und die berichtete abnormale CP-Morphologie aus der Gehirnautopsie bei zwei Kearns-Sayre-Patienten sprechen ebenfalls für eine CP-Dysfunktion bei LHIPFOLD 4. Darüber hinaus fand das Team in zwei LHIPFOLDpat sehr hohe Konzentrationen von CSF-Sialinsäure ohne Beteiligung von Sialinsäure-verwandten Genen, wohingegen CP den Sialinsäure-Efflux-Transporter stark exprimiert. Das Team hat kürzlich auch eine stark verringerte CP-Größe nach automatischer Segmentierung in zwei anderen LHIPFOLD-Patientinnen gemessen. Alle diese Daten sprechen stark für eine CP-Dysfunktion bei LHIPFOLD.

Wenn die Hypothese richtig ist, bedeutet dies, dass über die CFD hinaus wahrscheinlich andere Liquoranomalien als Folge einer generalisierten CP-Dysfunktion vorliegen. Dies kann aus therapeutischer Sicht sehr interessant sein, da eine Folat-Supplementierung insbesondere bei manchen Patienten einen deutlichen, aber begrenzten therapeutischen Effekt hat. Um unsere Hypothese zu beurteilen, gibt es leider keine klinischen Untersuchungen zur Bewertung der CP-Funktionen, wohingegen CP-Dysfunktion/-Veränderung als potenzielle Ursache für die Pathogenese mehrerer häufiger neurologischer Erkrankungen vermutet wird (im folgenden Text wird das Team Dysfunktion sowohl für Dysfunktion als auch für Veränderung verwenden). ). Da das Team davon ausgeht, dass die CP-Dysfunktion bei LHIPFOLD besonders schwerwiegend ist, wie die tiefe CFD vermuten lässt, hält das Team das LHIPFOLD-Syndrom für ein sehr nützliches klinisches Modell, um die Fähigkeit einiger relevanter Diagnoseinstrumente zur Bewertung der CP-Funktion zu validieren. Daher sind die Ziele des Projekts:

1. Beweisen Sie eine CP-Dysfunktion bei LHIPFOLD durch die Identifizierung spezifischer und CP-bezogener MRT- und biochemischer Signaturen mithilfe CP-zentrierter Bildgebung sowie Metabolomik- und Proteomik-Ansätzen.
2. Identifizieren Sie CP-bezogene biochemische Biomarker in LHIPFOLD, die direkt einer Behandlung zugänglich sind.
3. Einrichtung bildgebender und biochemischer Diagnosetests zur Bewertung der CP-Funktion in der klinischen Praxis (Biomarker-basierter CP-Dysfunktions-Score).

Methodik Um die Ziele zu erreichen, wird das Team eine monozentrische diagnostische Phase-1-Fallkontrollstudie durchführen, die auf einem deskriptiven, deterministischen statistischen und mehrdimensionalen Clustering-Ansatz basiert und durch komplementäre Diagnosetools unterstützt wird, die speziell für die CP-Untersuchung von LHIPFOLDpat im Vergleich zu gesunden Freiwilligen (HV) entwickelt wurden neurologische Kontrollpatienten (NCpat). NCpat wird verwendet, um die Spezifität der in LHIPFOLDpat identifizierten CP-bezogenen Signaturen zu bewerten. Das Team geht davon aus, dass die Befunde in einigen NCpat denen von HV ähneln, in anderen jedoch eine leichte bis mittelschwere CP-Dysfunktion widerspiegeln. Mit AP-HP als Studiensponsor wird das Team die Genehmigung der Forschungsethikkommission für eine „Jardé 1“-Studie gemäß den geltenden Gesetzen und behördlichen Anforderungen einholen.

- Auswahl und Rekrutierung von Patienten und Kontrollpersonen. Die Probanden werden prospektiv über einen Zeitraum von zwei Jahren rekrutiert: 1) LHIPFOLDpat wird wie zuvor beschrieben ausgewählt; 2)HV wird durch das übliche Ausschreibungsverfahren rekrutiert und nach Alter und Geschlecht mit LHIPFOLDpat abgeglichen; 3) Bei NCpat handelt es sich um alters- und geschlechtsangepasste Patienten mit bestimmten häufigen Hirnerkrankungen, die in der Abteilung für Neurologie häufig untersucht werden: Multiple Sklerose, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, frontotemporale Demenz, idiopathische intrakranielle Hypertonie und Normaldruckhydrozephalus. Die Diagnose dieser Erkrankungen wird nach den neuesten Leitlinien von den auf die jeweilige Erkrankung spezialisierten Neurologen gestellt. Bezüglich der zu rekrutierenden Stichprobe berücksichtigte das Team zwei Einschränkungen: Die Anzahl der LHIPFOLDpat ist begrenzt; Bei der Studie handelt es sich nicht um einen einfachen deterministischen Vergleich mit einer Kontrollgruppe, sondern vielmehr um eine mehrdimensionale Analyse, die zur Identifizierung CP-bezogener Signaturen durch homogene Patientencluster führt. Die Strategie bestand daher darin, eine globale Stichprobengröße zu ermitteln, die zu einer homogenen Klassifizierung der Patienten auf der Grundlage von 5 oder 6 Biomarkern führen würde. Nach der Donicar-Formel5 sollten 2^6 Patienten, die mithilfe einer stratifizierten Stichprobentechnik sorgfältig ausgewählt wurden, dies ermöglichen. Zu diesen 64 Patienten gehören 15 LHIPFOLDpat und eine gleiche Anzahl von 25 HV- und 25 NCpat-Patienten. Darüber hinaus liefert diese Stichprobengröße unter Beibehaltung des deterministischen Ansatzes und basierend auf einer Simulationsstudie, die den Mittelwert und die Standardabweichung von CSF 5MTHF in LHIPFOLDpat und NCpat (3,85 +/- 2,67 bzw. 49,53 +/- 13,35) mit 15 bzw. 25 Probanden integriert eine Trennschärfe von mehr als 95 %, um mit einem Wilcoxon-Rank-Sum-Test einen Unterschied zwischen diesen beiden Gruppen zu zeigen (beachten Sie, dass die Werte in HV derzeit nicht bekannt sind).

Das Team wird MRT-Daten des Gehirns (mit Blut-Gadolinium-Injektion) sowie Blut- und Liquorproben von allen Probanden erfassen. LHIPFOLDpat und NCpat werden sich diesen Eingriffen im Rahmen der Standardversorgung in der neurologischen Abteilung des Pitié-Salpêtrière-Krankenhauses unterziehen. HV wird eines Tages in unserem klinischen Untersuchungszentrum stationär behandelt. Alle Probanden unterzeichnen eine Einverständniserklärung und erklären sich damit einverstanden, sich einer MRT-Untersuchung sowie einer Blut- und Liquorprobenahme zu Forschungszwecken für HV sowie zusätzlicher MRT-Zeiterfassung und Probenvolumina für Patienten zu unterziehen.

• Gehirn-MRT-Studie Die Gehirn-MRT wird bei 3 TESLA (Siemens PRISMA) im Centre for Neuroimaging Research (CENIR), der Bildgebungsplattform des Paris Brain Institute (ICM), durchgeführt. Das Team wird sowohl die CP-Morphologie als auch die CP-Funktion bewerten: 1/Für die CP-morphologische Analyse wird das Team CP-Volumina messen und Texturparameter extrahieren. Die CP-Segmentierung wird mithilfe einer am Standort entwickelten automatisierten Software durchgeführt. Die Texturanalyse wird mithilfe der MP2RAGE-MRT-Sequenz durchgeführt. Die Beurteilung der 2/CP-Funktion umfasst quantitative Messungen der Kapillarpermeabilität und der makrovaskulären Perfusion. Um die CP-Permeabilität zu untersuchen, wird eine dynamische T1-Perfusionssequenz mit Gadoliniumverstärkung verwendet; t-TRANS und andere regionale Werte werden extrahiert. Die Nachbearbeitung erfolgt mit der Software Syngovia (Siemens). Um die makrovaskuläre Perfusion von CP zu untersuchen, wird das Team eine kürzere Version der zuvor veröffentlichten dynamischen Arterial Spin Labeling-Perfusion (ohne Gadolinium) verwenden 6. Mit dieser Sequenz kann das Team die arterielle Transitzeit und den scheinbaren Blutfluss beurteilen. Die Datenanalyse wird am CENIR durchgeführt.
• Entdeckung von CP-Dysfunktions-Biomarker-Kandidaten in Liquor-/Blutkompartimenten. Zwei gemischte Ansätze werden verwendet, um die Top-10-Biomarker-Kandidaten (a priori 5 Metaboliten und 5 Proteine) auszuwählen, die durch eine gezielte und vollständig quantitative Analyse untersucht werden: i) ungezielte Metabolomik und Proteomik (die Ergebnisse werden überprüft, um einen möglichen Zusammenhang mit der CP-Funktion zu beurteilen); und ii) hypothesengesteuerter Ansatz: Zusätzlich zu 5MTHF identifizierte das Team basierend auf Daten aus der Literatur und öffentlich zugänglichen biologischen Datenbanken auch Metaboliten (einschließlich Ascorbinsäure und Sialinsäure), die offenbar spezifisch durch CP transportiert werden, und Proteine speziell vom CP ausgedrückt (einschließlich TRPM3 und Klotho). Da Blutkonzentrationen die Liquorkonzentrationen einiger Moleküle beeinflussen können, plant das Team, gleichzeitig entnommene Blut- und Liquorproben zu analysieren und ein Konzentrationsverhältnis von Liquor/Blut zu berechnen.

Für die ungezielte Metabolomik werden Stoffwechselextrakte aus Liquor- und Plasmaproben nach der Methanol-unterstützten Proteinfällung gewonnen und mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) analysiert, während das Team routinemäßig 7 durchführt. Eine Kombination aus zwei komplementären LC- HRMS-Plattformen werden verwendet, um sowohl hydrophobe als auch polare Metaboliten zu profilieren8. Die Datenvorbehandlung und statistische Analyse erfolgt mithilfe von Workflow4Metabolomics (W4M), einer kollaborativen Open-Source-Online-Plattform für computergestützte Metabolomik. Die Annotation von Datensätzen und die Identifizierung biologisch relevanter Signale werden mithilfe von „internen“ Spektralbibliotheken und MS/MS-Experimenten (Tandem-Massenspektrometrie) durchgeführt. Dank der Normalisierung anhand von Qualitätskontrollproben wird eine relative Quantifizierung von ca. 250 Metaboliten erreicht. Für die gezielte Metabolomik wird CSF 5MTHF routinemäßig im auf Neurometabolismus spezialisierten Necker-Labor gemessen, wobei sehr empfindliche und spezifische Analysemethoden (Flüssigkeitschromatographie kombiniert mit Tandem-MS) zum Einsatz kommen. Das Team ist dabei, im gleichen Lauf Ascorbinsäure- und Sialinsäure-Messungen einzubeziehen. Abhängig von der chemischen Natur der in der ungezielten Studie identifizierten Metabolit-Biomarker-Kandidaten werden eine oder mehrere neue Methoden zur robusten Quantifizierung mithilfe stabiler Isotope entwickelt.

Eine vorläufige proteomische Studie am Liquor eines Patienten mit hohem Liquorproteingehalt und einer Kontrolle wird es uns ermöglichen, ein Probenvorbereitungsprotokoll zu erstellen, eine massenspektrometrische Analysemethode und einen Datenanalyse-Workflow auszuwählen. Das Ziel ist zweifach: die Extraktion von Proteinen zu optimieren und den Vergleich sehr unterschiedlicher CSFs zu ermöglichen, um eine Analysestrategie zu entwickeln, die es uns ermöglicht, Biomarker zu identifizieren. Die Studie wird unter Verwendung eines markierungsfreien Ansatzes durchgeführt, um die Variabilität und die Anzahl der Schritte zu minimieren und insbesondere den Dynamikbereich der Probe nicht einzuschränken. Alle bioinformatischen Analysen werden mit myProMS9 durchgeführt, unserer Software zur Verwaltung und Analyse proteomischer Daten, die am Institut Curie in Zusammenarbeit mit der von Dr. E. Barillot geleiteten Bioinformatikplattform INSERM U900 entwickelt wurde. Für den gezielten proteomischen Ansatz wird das Team das Fachwissen über gezielte MS mit stabil isotopenmarkierten internen Standardpeptiden nutzen, dem Goldstandardansatz für die Proteinquantifizierung in biologischen Flüssigkeiten, der zu hoher Robustheit, hoher Empfindlichkeit und Multiplex-Analyse führt10.

- Cross-Data-Analyse Das Team wird klinische und biologische Datensätze und Erkenntnisse aus der MRT- und biologischen Probenanalyse zentral verwalten, analysieren und integrieren, um eine globale CP-bezogene Signatur bei LHIPFOLD-Patienten zu identifizieren. Mit diesen Daten wird das Team einen CP-Dysfunktions-Score für den Einsatz in der klinischen Routinepraxis erstellen, der zur Untersuchung von CP bei neurologischen Patienten dienen soll.