Choroid Plexus Dysfunktion vid neurologiska sjukdomar (PLEXFOLD)

Cerebral folatbrist (CFD) är ett tillstånd som definieras av låg koncentration (<41 nM) av 5-metyltetrahydrofolat (5MTHF, den biologiskt aktiva formen av folat) i cerebrospinalvätskan (CSF) 1. CFD anses vara av "primär" ursprung om det är associerat med flera genetiska sjukdomar som involverar folatmetabolism, vilket leder till allvarliga motoriska och kognitiva manifestationer. CFD kan också vara "sekundär", det vill säga associerad med olika bestämda sjukdomar såsom genetiska mitokondriella sjukdomar och även oidentifierade sjukdomar. I sekundär CFD förstås inte orsaken till CFD. I centrum identifierade teamet 16 CFD-patienter med gemensamma egenskaper: djup sekundär CFD (5MTHF<10nM medan folat i blodet är normalt), högprotein-CSF >1g/L (N<0,5) och en specifik involvering av hjärnvit substans, hyperintensiv på T2-vägd MRT. Teamet kallade detta syndrom "LHIPFOLD" för leukoencefalopati med CSF HIgh Protein and FOLate Deficiency (konfidentiellt, planerad inlämning i slutet av 2022). Inom det franska nätverket för laboratorier för metabolisk biokemi identifierade teamet 6 ytterligare LHIPFOLDpat (LHIPFOLD-patienter). De har en medelålder på 42 till 14 år (min 15; max 77) och ett könsförhållande på 1,8 (M/K). 9/22 hade antingen en stor mitokondriell DNA-deletion (Kearns-Sayre) eller bi-alleliska POLG-mutationer (mitokondriell DNA-replikationsdefekt). De övriga 13 patienterna var alla odiagnostiserade tills nyligen, men teamet fann i forskningssammanhang och validerade in vitro bialleliska varianter i 4/7 testade patienter inom gener från MRPS-familjen, kodande för subenheter av mitoribosomen.

LHIPFOLD-patienter har helt klart en defekt av intracerebral 5MTHF-transport, men utan mutation av hjärnans folattransportörer. Eftersom folat uteslutande transporteras från blod till hjärnan av choroid plexus (CP)2, antar teamet att CFD i LHIPFOLD beror på CP-dysfunktion. CP, lokaliserat i hjärnventriklarna, är ett vaskulariserat epitelialorgan som fungerar som en blod-CSF-barriär, som uttrycker många transportörer för molekyler som överförs från blodet till CSF och vice versa (avlägsnar avfallsprodukter från hjärnceller). CP utsöndrar även CSF och uttrycker CSF-utsöndrade proteiner relaterade till olika funktioner3.

Högprotein-CSF på grund av en förändring av blod-hjärnbarriären och rapporterad onormal CP-morfologi från hjärnobduktion hos två Kearns-Sayre-patienter är också för CP-dysfunktion i LHIPFOLD 4. Dessutom fann teamet i två LHIPFOLDpat mycket höga koncentrationer av CSF-sialinsyra utan inblandning av sialinsyrarelaterade gener medan CP starkt uttrycker sialinsyrautflödestransportören. Teamet mätte också nyligen kraftigt minskad CP-storlek efter automatisk segmentering i två andra LHIPFOLD pat. Alla dessa data talar starkt för CP-dysfunktion i LHIPFOLD.

Om hypotesen stämmer betyder det att utöver CFD, finns sannolikt andra CSF-avvikelser som en konsekvens av generaliserad CP-dysfunktion. Detta kan vara mycket intressant i termer av terapeutisk ansats, eftersom folattillskott har en tydlig men begränsad terapeutisk effekt, särskilt hos vissa patienter. Tyvärr, för att bedöma vår hypotes, finns det ingen tillgänglig klinisk utforskning för att utvärdera CP-funktioner, medan CP-dysfunktion/förändring föreslås vara en potentiell patogenesbidragsgivare i flera vanliga neurologiska sjukdomar (för följande text kommer teamet att använda dysfunktion för både dysfunktion och förändring ). Eftersom teamet tror att CP-dysfunktionen i LHIPFOLD är särskilt allvarlig, vilket antyds av den djupa CFD, anser teamet att LHIPFOLD-syndromet är en mycket användbar klinisk modell för att validera kapaciteten hos några relevanta diagnostiska verktyg för att utvärdera CP-funktionen. Därför är målen för projektet:

1. Bevisa CP-dysfunktion i LHIPFOLD, genom identifiering av specifika och CP-relaterade MRI och biokemiska signaturer, med hjälp av CP-centrerad bildbehandling och metabolomik och proteomikmetoder.
2. Identifiera CP-relaterade biokemiska biomarkörer i LHIPFOLD som är direkt mottagliga för behandling.
3. Uppsättning av bildbehandling och biokemiska diagnostiska tester för att utvärdera CP-funktion i klinisk praxis (biomarkörsbaserad CP-dysfunktionspoäng).

Metod För att nå målen kommer teamet att genomföra en monocentrisk diagnostisk fas 1 fallkontrollstudie, baserad på beskrivande, deterministisk statistisk och multidimensionell klustringsmetod, med stöd av kompletterande diagnostiska verktyg speciellt utformade för CP-utforskning av LHIPFOLDpat kontra friska frivilliga (HV) och neurologiska kontrollpatienter (NCpat). NCpat kommer att användas för att bedöma specificiteten hos de CP-relaterade signaturer som identifieras i LHIPFOLDpat. Teamet förväntar sig att fynden kommer att likna HV i vissa NCpat, men kommer att återspegla lätt till måttlig CP-dysfunktion i andra. Med AP-HP som studiesponsor kommer teamet att få godkännande av den forskningsetiska kommittén för en "Jardé 1"-studie, i enlighet med gällande lagar och regulatoriska krav.

-Patienter och kontroller urval och rekrytering Ämnen kommer att rekryteras prospektivt under en tvåårsperiod: 1)LHIPFOLDpat kommer att väljas ut enligt tidigare beskrivning; 2)HV kommer att rekryteras enligt det vanliga annonseringsförfarandet och kommer att matchas för ålder och kön med LHIPFOLDpat; 3) NCpat kommer att vara ålders- och könsmatchade patienter med tydliga vanliga hjärnsjukdomar som ofta utforskas på neurologiavdelningen: multipel skleros, amyotrofisk lateralskleros, Alzheimers sjukdom, frontotemporal demens, idiopatisk intrakraniell hypertoni och normaltryckshydrocefalus. Diagnosen av dessa sjukdomar kommer att göras enligt de senaste riktlinjerna av neurologer som är specialiserade på varje sjukdom. När det gäller provet som skulle rekryteras tog teamet hänsyn till två begränsningar: antalet LHIPFOLDpat är begränsat; studien är inte en enkel deterministisk jämförelse mot en kontrollgrupp utan mer en multidimensionell analys som leder till identifiering av CP-relaterade signaturer genom homogena patientkluster. Följaktligen var strategin att identifiera en global provstorlek som skulle leda till en homogen klassificering av patienter baserad på 5 eller 6 biomarkörer. Enligt Donicars formel5 bör 2^6 patienter som är korrekt valda med en stratifierad provtagningsteknik tillåta detta. Dessa 64 patienter kommer att inkludera 15 LHIPFOLDpat och lika många 25 HV och 25 NCpat. Med bibehållande av den deterministiska metoden och baserat på en simuleringsstudie som integrerar medelvärde och standardavvikelse för CSF 5MTHF i LHIPFOLDpat och NCpat (3,85 +/- 2,67 respektive 49,53 +/- 13,35) med 15 respektive 25 försökspersoner, ger denna provstorlek en effekt större än 95 % för att visa en skillnad med ett Wilcoxon Rank Sum-test mellan dessa två grupper (observera att värden i HV för närvarande är okända).

Teamet kommer att skaffa hjärn-MRI-data (med blodgadoliniuminjektion), blod- och CSF-prover från alla försökspersoner. LHIPFOLDpat och NCpat kommer att genomgå dessa procedurer som en del av standardvården på neurologiska avdelningen på Pitié-Salpêtrière Hospital. HV kommer en dag att vara inlagd på vår Klinisk Utredningscentral. Alla försökspersoner kommer att underteckna informerat samtycke och samtycker till att genomgå MRT-undersökning och blod- och CSF-provtagning för forskningsändamål för HV, och ytterligare MRT-tidsinsamling och provvolymer för patienter.

• Hjärn-MR-studie Hjärn-MR kommer att utföras vid 3 TESLA (Siemens PRISMA) vid Centre for Neuroimaging Research (CENIR), bildplattformen för Paris Brain Institute (ICM). Teamet kommer att bedöma både CP-morfologi och funktion: 1/för CP-morfologisk analys kommer teamet att mäta CP-volymer och extrahera texturparametrar. CP-segmentering kommer att utföras med hjälp av automatiserad programvara utvecklad på platsen. Texturanalys kommer att utföras med MP2RAGE MRI-sekvensen. 2/CP-funktionsbedömning kommer att innefatta kvantitativa mätningar av kapillärpermeabiliteten och makrovaskulär perfusion. För att utforska CP-permeabilitet kommer dynamisk T1-perfusionssekvens med gadoliniumförstärkning att användas; t-TRANS och andra regionala värden kommer att extraheras. Efterbehandling kommer att utföras med programvaran Syngovia (Siemens). För att utforska CP makrovaskulär perfusion kommer teamet att använda en kortare version av den dynamiska arteriell spinnmärkning perfusion (utan gadolinium) publicerad tidigare 6. Med denna sekvens kommer teamet att kunna uppskatta den arteriella transittiden och det uppenbara blodflödet. Dataanalys kommer att utföras på CENIR.
• Upptäckt av CP-dysfunktion biomarkörkandidater i CSF/blodkompartment Två blandade tillvägagångssätt kommer att användas för att välja de 10 bästa biomarkörkandidaterna (a priori 5 metaboliter och 5 proteiner) som kommer att undersökas genom en målinriktad och helt kvantitativ analys: i) oriktad metabolomik och proteomik (fynden kommer att granskas för att bedöma en möjlig koppling till CP-funktionen); och ii) hypotesdrivet tillvägagångssätt: förutom 5MTHF, baserat på data från litteraturen och allmänt tillgänglig biologisk databas, identifierade teamet också metaboliter (inklusive askorbinsyra och sialinsyra) som verkar transporteras specifikt av CP, och proteiner specifikt uttryckt av CP (inklusive TRPM3 och Klotho). Eftersom blodkoncentrationer kan påverka CSF-koncentrationer för vissa molekyler, planerar teamet att analysera blod och CSF-prover samtidigt, med beräkning av en CSF/Blod-kvot av koncentrationer.

För oriktad metabolomik kommer metaboliska extrakt av CSF och plasmaprov att erhållas efter metanolassisterad proteinutfällning och analyseras med vätskekromatografi kopplat till högupplöst masspektrometri (LC-HRMS) när teamet rutinmässigt utför 7. En kombination av två komplementära LC- HRMS-plattformar kommer att användas för att profilera både hydrofoba och polära metaboliter8. Dataförbehandling och statistiska analyser kommer att uppnås genom att använda Workflow4Metabolomics (W4M), som är en öppen källkodssamarbetande onlineplattform för beräkningsmetabolomik. Annotering av datamängder och identifiering av biologiskt relevanta signaler kommer att utföras med hjälp av "interna" spektralbibliotek och MS/MS-experiment (tandemmasspektrometri). Relativ kvantifiering av ~250 metaboliter kommer att uppnås tack vare normalisering med hjälp av kvalitetskontrollprover. För målinriktad metabolomik mäts CSF 5MTHF rutinmässigt i Neckers laboratorium specialiserat på neurometabolism, med mycket känsliga och specifika analysmetoder (vätskekromatografi avstavad till tandem MS). Teamet håller på att inkludera åtgärder för askorbinsyra och sialinsyra i samma körning. Beroende på den kemiska naturen hos metabolitbiomarkörkandidaterna som identifierats i den oriktade studien kommer en eller några nya metoder för robust kvantifiering med hjälp av stabila isotoper att utvecklas.

En preliminär proteomisk studie på CSF hos en patient med högt CSF-protein och en kontroll kommer att tillåta oss att upprätta ett provberedningsprotokoll, välja en masspektrometrianalysmetod och dataanalys arbetsflöde. Målet är tvåfaldigt: att optimera extraktionen av proteiner och att tillåta jämförelse av mycket olika CSF för att utveckla en analytisk strategi som gör det möjligt för oss att identifiera biomarkörer. Studien kommer att utföras genom att använda ett etikettfritt tillvägagångssätt för att minimera variationen, antalet steg och särskilt inte för att begränsa provets dynamiska omfång. Alla bioinformatiska analyser kommer att utföras med myProMS9, vår proteomiska datahanterings- och analysmjukvara utvecklad vid Institut Curie i samarbete med INSERM U900 bioinformatikplattform som regisserats av Dr E. Barillot. För det riktade proteomiska tillvägagångssättet kommer teamet att använda expertis på riktad MS med stabila isotopmärkta interna standardpeptider, guldstandardmetoden för proteinkvantifiering i biologisk vätska, vilket resulterar i hög robusthet, hög känslighet och multiplexanalys10.

-Krossdataanalys Teamet kommer centralt att hantera, analysera och integrera kliniska och biologiska datauppsättningar och kunskap som genereras av MRI och biologiska provanalyser för att identifiera en global CP-relaterad signatur hos LHIPFOLD-patienter. Med dessa data kommer teamet att fastställa en CP-dysfunktionspoäng för användning i rutinmässig klinisk praxis, avsedd att användas för att utforska CP hos neurologiska patienter.