Disfunción del plexo coroideo en enfermedades neurológicas (PLEXFOLD)

La deficiencia de folato cerebral (DFC) es una afección definida por una concentración baja (<41 nM) de 5-metiltetrahidrofolato (5MTHF, la forma biológicamente activa de folato) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) 1. La DFC se considera de carácter "primario". origen si se asocia con varias enfermedades genéticas que involucran el metabolismo del folato, lo que lleva a manifestaciones motoras y cognitivas graves. La CFD también puede ser "secundaria", es decir, asociada con diversas enfermedades definidas, como enfermedades genéticas mitocondriales y también enfermedades no identificadas. En la CFD secundaria, no se comprende la causa de la CFD. En el centro, el equipo identificó a 16 pacientes con CFD con características comunes: CFD secundaria profunda (5MTHF<10nM mientras que el folato en sangre es normal), LCR alto en proteínas >1g/L (N<0,5) y una afectación específica de la sustancia blanca del cerebro. hiperintenso en la resonancia magnética ponderada en T2. El equipo llamó a este síndrome "LHIPFOLD" por leucoencefalopatía con alto contenido de proteínas en el LCR y deficiencia de folato (confidencial, presentación prevista para finales de 2022). Dentro de la red francesa de laboratorios de bioquímica metabólica, el equipo identificó seis LHIPFOLDpat (pacientes LHIPFOLD). Tienen una edad media de 42 a 14 años (mín. 15; máx. 77) y una proporción de sexos de 1,8 (hombres/mujeres). 9/22 tenían una gran deleción del ADN mitocondrial (Kearns-Sayre) o mutaciones bialélicas POLG (defecto de replicación del ADN mitocondrial). Los otros 13 pacientes no habían sido diagnosticados hasta hace poco, pero el equipo encontró en un contexto de investigación y validó variantes bialélicas in vitro en 4 de 7 pacientes analizados dentro de genes de la familia MRPS, que codifican subunidades del mitoribosoma.

Los pacientes con LHIPFOLD tienen claramente un defecto del transporte intracerebral de 5MTHF, pero sin mutación de los transportadores de folato cerebrales. Dado que el folato se transporta exclusivamente desde la sangre al cerebro a través del plexo coroideo (CP)2, el equipo plantea la hipótesis de que la CFD en LHIPFOLD se debe a una disfunción de la CP. La PC, localizada en los ventrículos del cerebro, es un órgano epitelial vascularizado que actúa como una barrera sangre-LCR, expresando numerosos transportadores para la transferencia de moléculas de la sangre al LCR y viceversa (eliminando los productos de desecho de las células cerebrales). La CP también secreta LCR y expresa proteínas secretadas por el LCR relacionadas con diversas funciones3.

El LCR alto en proteínas debido a una alteración de la barrera hematoencefálica y la morfología anormal de la PC informada en la autopsia cerebral en dos pacientes de Kearns-Sayre también favorecen la disfunción de la PC en LHIPFOLD 4. Además, en dos LHIPFOLDpat, el equipo encontró concentraciones muy altas de Ácido siálico en el LCR sin la participación de genes relacionados con el ácido siálico, mientras que CP expresa fuertemente el transportador de eflujo de ácido siálico. El equipo también midió recientemente un tamaño de CP fuertemente disminuido después de la segmentación automática en otros dos pat LHIPFOLD. Todos estos datos apoyan firmemente la disfunción de la PC en LHIPFOLD.

Si la hipótesis es correcta, significa que, además de la CFD, probablemente existan otras anomalías del LCR como consecuencia de una disfunción generalizada de la PC. Esto puede ser muy interesante en términos de enfoque terapéutico, ya que la suplementación con folato tiene un efecto terapéutico claro pero limitado, especialmente en algunos pacientes. Desafortunadamente, para evaluar nuestra hipótesis, no existe una exploración clínica disponible para evaluar las funciones de la PC, mientras que la disfunción/alteración de la PC se sugiere como un posible contribuyente a la patogénesis en varias enfermedades neurológicas comunes (para el siguiente texto, el equipo utilizará la disfunción tanto para la disfunción como para la alteración). ). Como el equipo piensa que en LHIPFOLD la disfunción de la PC es particularmente grave, como lo sugiere la CFD profunda, el equipo considera el síndrome de LHIPFOLD un modelo clínico muy útil para validar la capacidad de algunas herramientas de diagnóstico relevantes para evaluar la función de la PC. Por tanto, los objetivos del proyecto son:

1. Demuestre la disfunción de la PC en LHIPFOLD, mediante la identificación de firmas bioquímicas y de resonancia magnética específicas y relacionadas con la PC, utilizando imágenes centradas en la PC y enfoques metabolómicos y proteómicos.
2. Identificar biomarcadores bioquímicos relacionados con la PC en LHIPFOLD directamente susceptibles de tratamiento.
3. Configuración de pruebas de diagnóstico bioquímico y de imágenes para evaluar la función de la PC en la práctica clínica (puntuación de disfunción de la PC basada en biomarcadores).

Metodología Para alcanzar los objetivos, el equipo llevará a cabo un estudio de casos y controles de fase 1 de diagnóstico monocéntrico, basado en una estadística descriptiva, determinista y un enfoque de agrupamiento multidimensional, respaldado por herramientas de diagnóstico complementarias diseñadas específicamente para la exploración de CP de LHIPFOLDpat versus voluntarios sanos (HV) y Pacientes de control neurológico (NCpat). NCpat se utilizará para evaluar la especificidad de las firmas relacionadas con CP identificadas en LHIPFOLDpat. El equipo espera que los hallazgos sean similares a los de HV en algunos NCpat, pero reflejen una disfunción de la CP de leve a moderada en otros. Con AP-HP como patrocinador del estudio, el equipo obtendrá la aprobación del Comité de Ética en Investigación para un estudio "Jardé 1", de acuerdo con la legislación y los requisitos reglamentarios vigentes.

-Selección y reclutamiento de pacientes y controles. Los sujetos serán reclutados prospectivamente durante un período de dos años: 1) LHIPFOLDpat será seleccionado como se describió anteriormente; 2) HV será reclutado mediante el procedimiento de publicidad habitual y será emparejado por edad y sexo con LHIPFOLDpat; 3) NCpat serán pacientes de la misma edad y sexo con enfermedades cerebrales comunes definidas exploradas con frecuencia en el departamento de Neurología: esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, hipertensión intracraneal idiopática e hidrocefalia de presión normal. El diagnóstico de estas enfermedades se realizará según las últimas directrices por parte de los neurólogos especializados en cada enfermedad. En cuanto a la muestra a reclutar, el equipo tuvo en cuenta dos limitaciones: el número de LHIPFOLDpat es limitado; El estudio no es una simple comparación determinista con un grupo de control, sino más bien un análisis multidimensional que conduce a la identificación de firmas relacionadas con la PC a través de grupos homogéneos de pacientes. En consecuencia, la estrategia fue identificar un tamaño de muestra global que permitiera una clasificación homogénea de los pacientes en función de 5 o 6 biomarcadores. Según la fórmula de Donicar5 2^6 pacientes adecuadamente seleccionados mediante una técnica de muestreo estratificado deberían permitir esto. Estos 64 pacientes incluirán 15 LHIPFOLDpat y un número igual de 25 HV y 25 NCpat. Además, manteniendo el enfoque determinista y basándose en un estudio de simulación que integra la media y la desviación estándar de LCR 5MTHF en LHIPFOLDpat y NCpat (3,85 +/- 2,67 y 49,53 +/- 13,35 respectivamente) con 15 y 25 sujetos respectivamente, este tamaño de muestra proporciona un poder superior al 95% para demostrar una diferencia con una prueba de suma de rangos de Wilcoxon entre estos dos grupos (es de destacar que los valores en HV se desconocen actualmente).

El equipo adquirirá datos de resonancia magnética cerebral (con inyección de gadolinio en sangre), muestras de sangre y LCR de todos los sujetos. LHIPFOLDpat y NCpat se someterán a estos procedimientos como parte de la atención estándar en el Departamento de Neurología del Hospital Pitié-Salpêtrière. HV quedará hospitalizado un día en nuestro Centro de Investigación Clínica. Todos los sujetos firmarán el consentimiento informado y aceptarán someterse a un examen de resonancia magnética y a una muestra de sangre y LCR con fines de investigación para HV, y tiempo adicional de adquisición de resonancia magnética y volúmenes de muestra para los pacientes.

• Estudio de resonancia magnética cerebral La resonancia magnética cerebral se realizará en 3 TESLA (Siemens PRISMA) en el Centro de Investigación en Neuroimagen (CENIR), la plataforma de imágenes del Instituto del Cerebro de París (ICM). El equipo evaluará tanto la morfología como la función de la PC: 1/para el análisis morfológico de la PC, el equipo medirá los volúmenes de la PC y extraerá los parámetros de textura. La segmentación de CP se realizará utilizando software automatizado desarrollado en el sitio. El análisis de textura se realizará utilizando la secuencia de resonancia magnética MP2RAGE. La evaluación de la función 2/CP incluirá mediciones cuantitativas de la permeabilidad capilar y la perfusión macrovascular. Para explorar la permeabilidad de la PC, se utilizará una secuencia de perfusión dinámica T1 con realce con gadolinio; Se extraerán t-TRANS y otros valores regionales. El posprocesamiento se realizará utilizando el software Syngovia (Siemens). Para explorar la perfusión macrovascular de la PC, el equipo utilizará una versión más corta de la perfusión dinámica de etiquetado de giro arterial (sin gadolinio) publicada anteriormente 6. Con esta secuencia el equipo podrá apreciar el tiempo de tránsito arterial y el flujo sanguíneo aparente. El análisis de datos se realizará en CENIR.
• Descubrimiento de candidatos a biomarcadores de disfunción de la PC en compartimentos de LCR/sangre Se utilizarán dos enfoques mixtos para seleccionar los 10 mejores candidatos a biomarcadores (a priori, 5 metabolitos y 5 proteínas) que se investigarán mediante un análisis dirigido y totalmente cuantitativo: i) metabolómica no dirigida y proteómica (los hallazgos se revisarán para evaluar un posible vínculo con la función CP); y ii) enfoque basado en hipótesis: además del 5MTHF, basándose en datos de la literatura y de una base de datos biológica disponible públicamente, el equipo también identificó metabolitos (incluidos el ácido ascórbico y el ácido siálico) que parecen ser transportados específicamente por la CP, y proteínas. expresado específicamente por el Partido Comunista (incluidos TRPM3 y Klotho). Como las concentraciones en sangre pueden influir en las concentraciones de algunas moléculas en el LCR, el equipo planea analizar la sangre y el LCR muestreados al mismo tiempo, calculando una relación de concentraciones entre LCR y sangre.

Para la metabolómica no dirigida, se obtendrán extractos metabólicos de LCR y muestras de plasma después de la precipitación de proteínas asistida por metanol y se analizarán mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS) mientras el equipo realiza de forma rutinaria 7. Una combinación de dos LC- Se utilizarán plataformas HRMS para perfilar metabolitos tanto hidrofóbicos como polares8. El pretratamiento de datos y los análisis estadísticos se lograrán mediante el uso de Workflow4Metabolomis (W4M), que es una plataforma colaborativa en línea de código abierto para metabolómica computacional. La anotación de conjuntos de datos y la identificación de señales biológicamente relevantes se realizarán mediante bibliotecas espectrales "internas" y experimentos de MS/MS (espectrometría de masas en tándem). Se logrará una cuantificación relativa de ~250 metabolitos gracias a la normalización mediante muestras de control de calidad. Para la metabolómica específica, el 5MTHF del LCR se mide de forma rutinaria en el laboratorio Necker especializado en neurometabolismo, utilizando métodos analíticos muy sensibles y específicos (cromatografía líquida con guión de MS en tándem). El equipo está en el proceso de incluir en la misma serie medidas de ácido ascórbico y ácido siálico. Dependiendo de la naturaleza química de los candidatos a biomarcadores de metabolitos identificados en el estudio no dirigido, se desarrollarán uno o algunos métodos nuevos para una cuantificación sólida utilizando isótopos estables.

Un estudio proteómico preliminar en el LCR de un paciente con alto contenido de proteínas en el LCR y un control nos permitirá establecer un protocolo de preparación de muestras, seleccionar un método de análisis de espectrometría de masas y un flujo de trabajo de análisis de datos. El objetivo es doble: optimizar la extracción de proteínas y permitir comparar LCR muy diferentes para desarrollar una estrategia analítica que nos permita identificar biomarcadores. El estudio se llevará a cabo utilizando un enfoque sin etiquetas para minimizar la variabilidad, el número de pasos y especialmente no restringir el rango dinámico de la muestra. Todos los análisis bioinformáticos se realizarán con myProMS9, nuestro software de análisis y gestión de datos proteómicos desarrollado en el Institut Curie en colaboración con la plataforma bioinformática INSERM U900 dirigida por el Dr. E. Barillot. Para el enfoque proteómico dirigido, el equipo utilizará la experiencia en EM dirigida con péptidos estándar internos marcados con isótopos estables, el enfoque estándar de oro para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos, lo que resulta en una alta robustez, alta sensibilidad y análisis multiplex10.

-Análisis de datos cruzados El equipo gestionará, analizará e integrará de forma centralizada conjuntos de datos clínicos y biológicos y conocimientos generados por la resonancia magnética y el análisis de muestras biológicas para identificar una firma global relacionada con la PC en pacientes con LHIPFOLD. Con estos datos, el equipo establecerá una puntuación de disfunción de la PC para su uso en la práctica clínica habitual, destinada a explorar la PC en pacientes neurológicos.