Dysfunkcja splotu naczyniówkowego w chorobach neurologicznych (PLEXFOLD)

Mózgowy niedobór folianów (CFD) to stan definiowany przez niskie stężenie (<41 nM) 5-metylotetrahydrofolianu (5MTHF, biologicznie aktywna postać kwasu foliowego) w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). 1. CFD uważa się za „pierwotny” pochodzenia, jeśli jest powiązany z kilkoma chorobami genetycznymi związanymi z metabolizmem kwasu foliowego, prowadzącymi do poważnych objawów motorycznych i poznawczych. CFD może mieć również charakter „wtórny”, tj. związany z różnymi określonymi chorobami, takimi jak genetyczne choroby mitochondrialne, a także choroby niezidentyfikowane. W przypadku wtórnych CFD przyczyna CFD nie jest znana. W ośrodku zespół zidentyfikował 16 pacjentów z CFD o wspólnych cechach: głęboka wtórna CFD (5MTHF < 10 nM, podczas gdy kwas foliowy we krwi jest w normie), wysokobiałkowy płyn mózgowo-rdzeniowy > 1 g/l (N < 0,5) i specyficzne zajęcie istoty białej mózgu, hiperintensywne w MRI ważonym T2. Zespół nazwał ten zespół „LHIPFOLD” w przypadku leukoencefalopatii z niedoborem wysokiego białka i kwasu foliowego w płynie mózgowo-rdzeniowym (poufne, planowane zgłoszenie pod koniec 2022 r.). W ramach francuskiej sieci laboratoriów biochemii metabolicznej zespół zidentyfikował 6 dodatkowych LHIPFOLDpat (pacjentów z LHIPFOLD). Ich średni wiek wynosi 42–14 lat (min. 15; maks. 77), a stosunek płci wynosi 1,8 (M/K). 9/22 miało albo dużą delecję mitochondrialnego DNA (Kearns-Sayre), albo dwualleliczne mutacje POLG (defekt replikacji mitochondrialnego DNA). Pozostałych 13 pacjentów do niedawna nie zostało zdiagnozowanych, ale zespół odkrył w kontekście badawczym i zweryfikował in vitro warianty bialleliczne u 4 z 7 badanych pacjentów w obrębie genów z rodziny MRPS, kodujących podjednostki mitorybosomu.

U pacjentów z LHIPFOLD wyraźnie występuje defekt wewnątrzmózgowego transportu 5MTHF, ale bez mutacji w mózgowych transporterach kwasu foliowego. Ponieważ kwas foliowy jest transportowany z krwi do mózgu wyłącznie przez splot naczyniówkowy (CP)2, zespół wysunął hipotezę, że CFD w LHIPFOLD wynika z dysfunkcji CP. CP, zlokalizowany w komorach mózgu, jest unaczynionym narządem nabłonkowym, który działa jak bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, wyrażając liczne transportery do przenoszenia cząsteczek z krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego i odwrotnie (usuwając produkty przemiany materii z komórek mózgowych). CP wydziela również CSF i wyraża białka wydzielane przez CSF związane z różnymi funkcjami3.

Wysokobiałkowy płyn mózgowo-rdzeniowy wynikający ze zmiany bariery krew-mózg oraz zgłoszona nieprawidłowa morfologia CP na podstawie autopsji mózgu u dwóch pacjentów z Kearns-Sayre również przemawiają za dysfunkcją CP w badaniu LHIPFOLD 4. Ponadto w dwóch badaniach LHIPFOLD zespół stwierdził bardzo wysokie stężenia Kwas sialowy CSF bez udziału genów związanych z kwasem sialowym, podczas gdy CP silnie wyraża transporter wypływu kwasu sialowego. Zespół niedawno zmierzył również silnie zmniejszony rozmiar PK po automatycznej segmentacji w dwóch innych patologiach LHIPFOLD. Wszystkie te dane zdecydowanie przemawiają za dysfunkcją PK w LHIPFOLD.

Jeśli hipoteza jest prawidłowa, oznacza to, że poza CFD prawdopodobnie istnieją inne nieprawidłowości w płynie mózgowo-rdzeniowym, będące konsekwencją uogólnionej dysfunkcji PK. Może to być bardzo interesujące z punktu widzenia podejścia terapeutycznego, ponieważ suplementacja folianami ma wyraźny, ale ograniczony efekt terapeutyczny, szczególnie u niektórych pacjentów. Niestety, aby ocenić naszą hipotezę, nie ma dostępnych badań klinicznych pozwalających ocenić funkcje CP, podczas gdy dysfunkcja/zmiana CP jest sugerowana jako potencjalny czynnik przyczyniający się do patogenezy kilku powszechnych chorób neurologicznych (w poniższym tekście zespół będzie używał dysfunkcji zarówno do dysfunkcji, jak i zmian ). Ponieważ zespół uważa, że ​​w przypadku LHIPFOLD dysfunkcja PK jest szczególnie poważna, jak sugeruje głęboka CFD, uważa zespół LHIPFOLD za bardzo przydatny model kliniczny do sprawdzenia przydatności niektórych odpowiednich narzędzi diagnostycznych do oceny funkcji MPD. Dlatego celami projektu są:

1. Udowodnić dysfunkcję CP w LHIPFOLD poprzez identyfikację specyficznych i związanych z CP MRI i sygnatur biochemicznych, stosując obrazowanie skupione na CP oraz podejścia metabolomiczne i proteomiczne.
2. Zidentyfikuj biomarkery biochemiczne związane z CP w LHIPFOLD bezpośrednio podatne na leczenie.
3. Zestawienie testów obrazowych i biochemicznych testów diagnostycznych do oceny funkcji CP w praktyce klinicznej (wynik dysfunkcji CP oparty na biomarkerach).

Metodologia Aby osiągnąć te cele, zespół przeprowadzi monocentryczne diagnostyczne badanie kliniczno-kontrolne fazy 1, oparte na opisowej, deterministycznej statystyce i wielowymiarowym podejściu do grupowania, wsparte uzupełniającymi narzędziami diagnostycznymi zaprojektowanymi specjalnie do badania CP LHIPFOLDpat w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami (HV) i pacjenci z kontrolą neurologiczną (NCpat). NCpat zostanie wykorzystany do oceny specyficzności podpisów związanych z CP zidentyfikowanych w LHIPFOLDpat. Zespół spodziewa się, że w niektórych NCpat wyniki będą podobne do HV, ale u innych będą odzwierciedlać niewielką lub umiarkowaną dysfunkcję PK. Dzięki AP-HP jako sponsorowi badania zespół uzyska zgodę Komisji ds. Etyki Badań Naukowych na badanie „Jardé 1”, zgodnie z obowiązującymi przepisami i wymogami regulacyjnymi.

- Wybór i rekrutacja pacjentów i osób kontrolnych Pacjenci będą rekrutowani prospektywnie w ciągu dwóch lat: 1) LHIPFOLDpat zostanie wybrany zgodnie z wcześniejszym opisem; 2) HV zostanie zatrudniony w drodze zwykłej procedury ogłaszania ogłoszeń i zostanie dobrany pod względem wieku i płci za pomocą LHIPFOLDpat; 3) NCpat to pacjenci dobrani pod względem wieku i płci, z określonymi, powszechnymi chorobami mózgu, często badanymi na oddziale neurologii: stwardnieniem rozsianym, stwardnieniem zanikowym bocznym, chorobą Alzheimera, otępieniem czołowo-skroniowym, idiopatycznym nadciśnieniem wewnątrzczaszkowym i wodogłowiem normalnego ciśnienia. Rozpoznanie tych chorób będzie stawiane według najnowszych wytycznych przez neurologów specjalizujących się w danej chorobie. Jeśli chodzi o rekrutowaną próbę, zespół wziął pod uwagę dwa ograniczenia: liczba LHIPFOLDpat jest ograniczona; badanie nie jest prostym deterministycznym porównaniem z grupą kontrolną, ale raczej wielowymiarową analizą prowadzącą do identyfikacji sygnatur związanych z porażeniem mózgowym poprzez jednorodne grupy pacjentów. W związku z tym strategia polegała na określeniu globalnej wielkości próby, która doprowadziłaby do jednorodnej klasyfikacji pacjentów w oparciu o 5 lub 6 biomarkerów. Według wzoru Donicara5 powinno na to pozwolić odpowiednio dobranych pacjentów metodą warstwowego doboru próby5 2^6. Tych 64 pacjentów będzie obejmować 15 LHIPFOLDpat i taką samą liczbę 25 HV i 25 NCpat. Ponadto, zachowując podejście deterministyczne i w oparciu o badanie symulacyjne integrujące średnią i odchylenie standardowe CSF 5MTHF w LHIPFOLDpat i NCpat (odpowiednio 3,85 +/- 2,67 i 49,53 +/- 13,35) odpowiednio z 15 i 25 pacjentami, taka wielkość próby zapewnia moc większą niż 95%, aby wykazać różnicę za pomocą testu sumy rang Wilcoxona pomiędzy tymi dwiema grupami (warto zauważyć, że wartości w HV są obecnie nieznane).

Zespół pozyska dane MRI mózgu (po wstrzyknięciu gadolinu do krwi), próbki krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego od wszystkich osób. LHIPFOLDpat i NCpat zostaną poddane tym zabiegom w ramach standardowej opieki na oddziale neurologii szpitala Pitié-Salpêtrière. HV będzie pewnego dnia hospitalizowany w naszym Centrum Badań Klinicznych. Wszyscy uczestnicy podpiszą świadomą zgodę i zgodzą się na poddanie się badaniu MRI oraz pobraniu próbek krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego do celów badawczych w kierunku HV, a także dodatkowemu pomiarowi czasu MRI i objętości próbek od pacjentów.

• Badanie MRI mózgu Badanie MRI mózgu zostanie wykonane w 3 TESLA (Siemens PRISMA) w Centrum Badań Neuroobrazowania (CENIR), platformie obrazowania Paryskiego Instytutu Mózgu (ICM). Zespół oceni zarówno morfologię, jak i funkcję CP: 1/w przypadku analizy morfologicznej CP zespół zmierzy objętości CP i wyodrębni parametry teksturalne. Segmentacja CP zostanie przeprowadzona przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania opracowanego na miejscu. Analiza tekstury zostanie przeprowadzona przy użyciu sekwencji MP2RAGE MRI. Ocena funkcji 2/CP będzie obejmować ilościowe pomiary przepuszczalności naczyń włosowatych i perfuzji makronaczyniowej. W celu zbadania przepuszczalności CP zostanie zastosowana dynamiczna sekwencja perfuzji T1 ze wzmocnieniem gadolinem; Wyodrębnione zostaną wartości t-TRANS i inne wartości regionalne. Przetwarzanie końcowe zostanie przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Syngovia (Siemens). Aby zbadać perfuzję makronaczyniową CP, zespół wykorzysta krótszą wersję dynamicznej perfuzji Arterial Spin Labeling (bez gadolinu) opublikowanej wcześniej 6. Dzięki tej sekwencji zespół będzie w stanie ocenić czas przejścia tętnic i pozorny przepływ krwi. Analiza danych zostanie przeprowadzona w CENIR.
• Odkrycie kandydatów na biomarkery dysfunkcji CP w płynie mózgowo-rdzeniowym/przedziałach krwi Do wyboru 10 najlepszych kandydatów na biomarkery (a priori 5 metabolitów i 5 białek), które zostaną zbadane za pomocą ukierunkowanej i w pełni ilościowej analizy, zostaną zastosowane dwa podejścia mieszane: i) nieukierunkowana metabolomika i proteomika (odkrycia zostaną poddane przeglądowi w celu oceny możliwego powiązania z funkcją CP); oraz ii) podejście oparte na hipotezach: oprócz 5MTHF, w oparciu o dane z literatury i publicznie dostępnej biologicznej bazy danych, zespół zidentyfikował także metabolity (w tym kwas askorbinowy i kwas sialowy), które wydają się być specyficznie transportowane przez CP, oraz białka wyraźnie wyrażone przez punkt kontrolny (w tym TRPM3 i Klotho). Ponieważ stężenie niektórych cząsteczek we krwi może wpływać na stężenie niektórych cząsteczek w płynie mózgowo-rdzeniowym, zespół planuje przeprowadzić analizę krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego pobranych w tym samym czasie, obliczając stosunek stężeń płynu mózgowo-rdzeniowego do krwi.

W przypadku nieukierunkowanej metabolomiki ekstrakty metaboliczne płynu mózgowo-rdzeniowego i próbki osocza zostaną uzyskane po wytrąceniu białek wspomaganym metanolem i poddane analizie za pomocą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS), którą zespół rutynowo wykonuje. 7. Połączenie dwóch uzupełniających się LC- Platformy HRMS zostaną wykorzystane do profilowania zarówno metabolitów hydrofobowych, jak i polarnych8. Wstępne przetwarzanie danych i analizy statystyczne zostaną przeprowadzone przy użyciu Workflow4Metabolomics (W4M), czyli wspólnej platformy internetowej o otwartym kodzie źródłowym do metabolomiki obliczeniowej. Adnotacja zbiorów danych i identyfikacja biologicznie istotnych sygnałów zostaną przeprowadzone przy użyciu „własnych” bibliotek widmowych i eksperymentów MS/MS (tandemowa spektrometria mas). Względna ocena ilościowa ~250 metabolitów zostanie osiągnięta dzięki normalizacji przy użyciu próbek kontroli jakości. W przypadku metabolomiki celowanej poziom 5MTHF w płynie mózgowo-rdzeniowym jest rutynowo oznaczany w laboratorium Neckera specjalizującym się w neurometabolizmie, przy użyciu bardzo czułych i specyficznych metod analitycznych (chromatografia cieczowa z łącznikiem tandemowej MS). Zespół jest w trakcie włączania do tej samej serii pomiarów kwasu askorbinowego i kwasu sialowego. W zależności od chemicznego charakteru kandydatów na biomarkery metabolitów zidentyfikowanych w badaniu nieukierunkowanym, opracowana zostanie jedna lub kilka nowych metod solidnej oceny ilościowej przy użyciu stabilnych izotopów.

Wstępne badanie proteomiczne płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta z wysokim poziomem białka płynu mózgowo-rdzeniowego oraz grupy kontrolnej pozwoli nam ustalić protokół przygotowania próbki, wybrać metodę analizy spektrometrią mas i przebieg analizy danych. Cel jest dwojaki: optymalizacja ekstrakcji białek i umożliwienie porównania bardzo różnych CSF w celu opracowania strategii analitycznej, która pozwoli nam zidentyfikować biomarkery. Badanie zostanie przeprowadzone przy zastosowaniu podejścia bez etykiet, aby zminimalizować zmienność, liczbę kroków, a zwłaszcza nie ograniczać zakresu dynamicznego próbki. Wszystkie analizy bioinformatyczne zostaną przeprowadzone za pomocą myProMS9, naszego oprogramowania do zarządzania i analizy danych proteomicznych opracowanego w Instytucie Curie we współpracy z platformą bioinformatyczną INSERM U900 kierowaną przez dr E. Barillota. W przypadku ukierunkowanego podejścia proteomicznego zespół wykorzysta wiedzę specjalistyczną na temat ukierunkowanego stwardnienia rozsianego ze stabilnymi znakowanymi izotopami peptydami będącymi standardem wewnętrznym, co stanowi złoty standard w zakresie ilościowego oznaczania białek w płynie biologicznym, co zapewnia wysoką niezawodność, wysoką czułość i analizę multipleksową10.

-Analiza danych krzyżowych Zespół będzie centralnie zarządzał, analizował i integrował zbiory danych klinicznych i biologicznych oraz wiedzę wygenerowaną w wyniku analizy MRI i próbek biologicznych w celu zidentyfikowania globalnego podpisu związanego z CP u pacjentów z LHIPFOLD. Na podstawie tych danych zespół ustali punktację dysfunkcji porażenia mózgowego do wykorzystania w rutynowej praktyce klinicznej i do badania porażenia mózgowego u pacjentów neurologicznych.