Dysfonctionnement du plexus choroïde dans les maladies neurologiques (PLEXFOLD)

La carence cérébrale en folate (CFD) est une affection définie par une faible concentration (<41 nM) de 5-méthyltétrahydrofolate (5MTHF, la forme biologiquement active du folate) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). 1. La CFD est considérée comme étant « primaire » origine si elle est associée à plusieurs maladies génétiques impliquant le métabolisme des folates, entraînant de graves manifestations motrices et cognitives. La CFD peut également être « secondaire », c'est-à-dire associée à diverses maladies définies telles que les maladies génétiques mitochondriales et également des maladies non identifiées. Dans le CFD secondaire, la cause du CFD n'est pas comprise. Au centre, l'équipe a identifié 16 patients atteints de CFD présentant des caractéristiques communes : CFD secondaire profond (5MTHF < 10 nM alors que le folate sanguin est normal), un LCR riche en protéines > 1 g/L (N < 0,5) et une atteinte spécifique de la substance blanche cérébrale, hyperintense en IRM pondérée T2. L’équipe a appelé ce syndrome « ​​LHIPFOLD » pour la leucoencéphalopathie avec déficit élevé en protéines du LCR et déficit en FOLate (soumission confidentielle et prévue fin 2022). Au sein du réseau français des laboratoires de biochimie métabolique, l’équipe a identifié 6 LHIPFOLDpat supplémentaires (patients LHIPFOLD). Ils ont un âge moyen de 42 à 14 ans (min 15 ; max 77) et un sex-ratio de 1,8 (H/F). 9/22 présentaient soit une délétion importante de l'ADN mitochondrial (Kearns-Sayre), soit des mutations bi-alléliques POLG (défaut de réplication de l'ADN mitochondrial). Les 13 autres patients n'étaient pas diagnostiqués jusqu'à récemment, mais l'équipe a trouvé dans un contexte de recherche et validé in vitro des variantes bi-alléliques chez 4/7 patients testés au sein des gènes de la famille MRPS, codant pour des sous-unités du mitoribosome.

Les patients LHIPFOLD présentent clairement un défaut de transport intracérébral du 5MTHF, mais sans mutation des transporteurs cérébraux du folate. Puisque le folate est exclusivement transporté du sang vers le cerveau par le plexus choroïde (CP)2, l’équipe émet l’hypothèse que la CFD dans LHIPFOLD est due à un dysfonctionnement du CP. Le CP, localisé dans les ventricules cérébraux, est un organe épithélial vascularisé qui agit comme une barrière sang-LCR, exprimant de nombreux transporteurs pour le transfert de molécules du sang vers le LCR et vice versa (éliminant les déchets des cellules cérébrales). Le CP sécrète également du CSF et exprime des protéines sécrétées par le CSF liées à diverses fonctions3.

Un LCR riche en protéines dû à une altération de la barrière hémato-encéphalique et une morphologie anormale de la CP rapportée lors d'une autopsie cérébrale chez deux patients de Kearns-Sayre sont également en faveur d'un dysfonctionnement de la CP dans LHIPFOLD 4. De plus, dans deux LHIPFOLDpat, l'équipe a trouvé des concentrations très élevées de L'acide sialique du CSF sans l'implication de gènes liés à l'acide sialique alors que le CP exprime fortement le transporteur d'efflux d'acide sialique. L’équipe a également récemment mesuré une taille de CP fortement réduite après segmentation automatique dans deux autres pats LHIPFOLD. Toutes ces données plaident fortement en faveur d'un dysfonctionnement de CP dans LHIPFOLD.

Si l’hypothèse est correcte, cela signifie qu’au-delà de la CFD, d’autres anomalies du LCR existent probablement en conséquence d’un dysfonctionnement généralisé de la PC. Cela peut s’avérer très intéressant en termes d’approche thérapeutique, dans la mesure où la supplémentation en folate a un effet thérapeutique évident mais limité, notamment chez certains patients. Malheureusement, pour évaluer notre hypothèse, il n'existe aucune exploration clinique disponible pour évaluer les fonctions de la CP, alors que le dysfonctionnement/l'altération de la CP est suggéré comme un contributeur potentiel à la pathogenèse de plusieurs maladies neurologiques courantes (pour le texte suivant, l'équipe utilisera le dysfonctionnement à la fois pour le dysfonctionnement et l'altération). ). Comme l'équipe pense que dans LHIPFOLD le dysfonctionnement de la CP est particulièrement sévère, comme le suggère la CFD profonde, l'équipe considère le syndrome de LHIPFOLD comme un modèle clinique très utile pour valider la capacité de certains outils de diagnostic pertinents à évaluer la fonction de la CP. Les objectifs du projet sont donc :

1. Prouver le dysfonctionnement de la CP dans LHIPFOLD, grâce à l'identification d'IRM et de signatures biochimiques spécifiques et liées à la CP, en utilisant des approches d'imagerie et de métabolomique et protéomique centrées sur la CP.
2. Identifiez les biomarqueurs biochimiques liés au CP dans LHIPFOLD directement susceptibles d'être traités.
3. Mise en place de tests d'imagerie et de diagnostic biochimique pour évaluer la fonction CP en pratique clinique (score de dysfonctionnement CP basé sur des biomarqueurs).

Méthodologie Pour atteindre les objectifs, l'équipe mènera une étude cas-témoins diagnostique monocentrique de phase 1, basée sur une approche descriptive, statistique déterministe et de regroupement multidimensionnel, soutenue par des outils de diagnostic complémentaires spécifiquement conçus pour l'exploration de CP de LHIPFOLDpat versus volontaires sains (HV) et patients sous contrôle neurologique (NCpat). NCpat sera utilisé pour évaluer la spécificité des signatures liées au CP identifiées dans LHIPFOLDpat. L'équipe s'attend à ce que les résultats soient similaires à ceux du HV chez certains NCpat, mais reflètent un dysfonctionnement léger à modéré du CP chez d'autres. Avec l'AP-HP comme sponsor de l'étude, l'équipe obtiendra l'accord du Comité d'Éthique de la Recherche pour une étude « Jardé 1 », conformément à la législation et aux exigences réglementaires en vigueur.

-Sélection et recrutement des patients et des contrôles Les sujets seront recrutés de manière prospective sur une période de deux ans : 1) LHIPFOLDpat sera sélectionné comme décrit précédemment ; 2) HV sera recruté par la procédure de publicité habituelle et sera apparié pour l'âge et le sexe avec LHIPFOLDpat ; 3) NCpat sera des patients de même âge et sexe atteints de maladies cérébrales courantes définies fréquemment explorées dans le service de neurologie : sclérose en plaques, sclérose latérale amyotrophique, maladie d'Alzheimer, démence frontotemporale, hypertension intracrânienne idiopathique et hydrocéphalie à pression normale. Le diagnostic de ces maladies sera posé selon les dernières directives par des neurologues spécialisés dans chaque maladie. Concernant l'échantillon à recruter, l'équipe a pris en compte deux contraintes : le nombre de LHIPFOLDpat est limité ; l'étude n'est pas une simple comparaison déterministe par rapport à un groupe témoin mais plutôt une analyse multidimensionnelle conduisant à l'identification de signatures liées à la CP à travers des groupes de patients homogènes. Par conséquent, la stratégie consistait à identifier une taille d’échantillon globale qui permettrait d’aboutir à une classification homogène des patients basée sur 5 ou 6 biomarqueurs. Selon la formule de Donicar5, 2^6 patients correctement sélectionnés par une technique d'échantillonnage stratifié devraient le permettre. Ces 64 patients comprendront 15 LHIPFOLDpat et un nombre égal de 25 HV et 25 NCpat. De plus, en gardant l'approche déterministe, et sur la base d'une étude de simulation intégrant la moyenne et l'écart type du LCR 5MTHF dans LHIPFOLDpat et NCpat (3,85 +/- 2,67 et 49,53 +/- 13,35 respectivement) avec respectivement 15 et 25 sujets, cette taille d'échantillon fournit une puissance supérieure à 95 % pour démontrer une différence avec un test Wilcoxon Rank Sum entre ces deux groupes (à noter, les valeurs en HV sont actuellement inconnues).

L'équipe acquerra des données d'IRM cérébrale (avec injection de gadolinium sanguin), des échantillons de sang et de LCR de tous les sujets. LHIPFOLDpat et NCpat subiront ces interventions dans le cadre des soins standards du service de neurologie de l'hôpital de la Pitié-Salpêtrière. HV sera hospitalisé un jour dans notre Centre d'Investigation Clinique. Tous les sujets signeront un consentement éclairé et accepteront de subir un examen IRM et un prélèvement de sang et de LCR à des fins de recherche pour l'HV, ainsi que du temps d'acquisition IRM et des volumes d'échantillons supplémentaires pour les patients.

• Étude IRM cérébrale L'IRM cérébrale sera réalisée à 3 TESLA (Siemens PRISMA) au Centre de Recherche en Neuroimagerie (CENIR), la plateforme d'imagerie de l'Institut du Cerveau de Paris (ICM). L'équipe évaluera à la fois la morphologie et la fonction du CP : 1/pour l'analyse morphologique du CP, l'équipe mesurera les volumes du CP et extraira les paramètres texturaux. La segmentation CP sera effectuée à l'aide d'un logiciel automatisé développé sur le site. L'analyse de texture sera réalisée à l'aide de la séquence MP2RAGE MRI. L'évaluation de la fonction 2/CP comprendra des mesures quantitatives de la perméabilité capillaire et de la perfusion macrovasculaire. Pour explorer la perméabilité du CP, une séquence de perfusion dynamique T1 avec rehaussement de gadolinium sera utilisée ; t-TRANS et d’autres valeurs régionales seront extraites. Le post-traitement sera effectué à l'aide du logiciel Syngovia (Siemens). Pour explorer la perfusion macrovasculaire CP, l'équipe utilisera une version plus courte de la perfusion dynamique Arterial Spin Labeling (sans gadolinium) publiée précédemment 6. Grâce à cette séquence, l'équipe pourra apprécier le temps de transit artériel et le débit sanguin apparent. L'analyse des données sera effectuée au CENIR.
• Découverte de candidats biomarqueurs de dysfonctionnement de la CP dans le LCR/compartiments sanguins Deux approches mixtes seront utilisées pour sélectionner les 10 meilleurs biomarqueurs candidats (a priori 5 métabolites et 5 protéines) qui seront étudiés par une analyse ciblée et entièrement quantitative : i) métabolomique non ciblée et protéomique (les résultats seront examinés pour évaluer un lien possible avec la fonction CP) ; et ii) approche fondée sur des hypothèses : en plus du 5MTHF, sur la base des données de la littérature et d'une base de données biologique accessible au public, l'équipe a également identifié des métabolites (dont l'acide ascorbique et l'acide sialique) qui semblent être spécifiquement transportés par le CP, et des protéines spécifiquement exprimé par le CP (dont TRPM3 et Klotho). Les concentrations sanguines pouvant influencer les concentrations de LCR pour certaines molécules, l'équipe prévoit d'analyser le sang et le LCR prélevés en même temps, avec calcul d'un rapport de concentrations LCR/Sang.

Pour la métabolomique non ciblée, des extraits métaboliques de LCR et des échantillons de plasma seront obtenus après précipitation des protéines assistée par méthanol et analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (LC-HRMS) comme l'équipe le réalise régulièrement 7. Une combinaison de deux LC- Les plates-formes HRMS seront utilisées pour profiler les métabolites hydrophobes et polaires8. Le prétraitement des données et les analyses statistiques seront réalisés à l'aide de Workflow4Metabolomics (W4M), qui est une plateforme collaborative en ligne open source pour la métabolomique informatique. L'annotation des ensembles de données et l'identification des signaux biologiquement pertinents seront effectuées à l'aide de bibliothèques spectrales « internes » et d'expériences MS/MS (spectrométrie de masse en tandem). La quantification relative d'environ 250 métabolites sera obtenue grâce à la normalisation à l'aide d'échantillons de contrôle qualité. Pour une métabolomique ciblée, le CSF 5MTHF est mesuré en routine dans le laboratoire Necker spécialisé en neurométabolisme, en utilisant des méthodes analytiques très sensibles et spécifiques (chromatographie liquide couplée à MS tandem). L’équipe est en train d’inclure dans la même analyse des mesures d’acide ascorbique et d’acide sialique. En fonction de la nature chimique des biomarqueurs métabolites identifiés dans l’étude non ciblée, une ou plusieurs nouvelles méthodes de quantification robuste utilisant des isotopes stables seront développées.

Une étude protéomique préliminaire sur le LCR d'un patient présentant un taux élevé de protéine CSF et un contrôle nous permettront d'établir un protocole de préparation des échantillons, de sélectionner une méthode d'analyse par spectrométrie de masse et un workflow d'analyse des données. L’objectif est double : optimiser l’extraction des protéines et permettre la comparaison de CSF très différents afin de développer une stratégie analytique qui permettra d’identifier des biomarqueurs. L'étude sera réalisée en utilisant une approche sans étiquette pour minimiser la variabilité, le nombre d'étapes et surtout ne pas restreindre la plage dynamique de l'échantillon. Toutes les analyses bioinformatiques seront réalisées avec myProMS9, notre logiciel de gestion et d'analyse de données protéomiques développé à l'Institut Curie en collaboration avec la plateforme bioinformatique INSERM U900 dirigée par le Dr E. Barillot. Pour l’approche protéomique ciblée, l’équipe utilisera l’expertise en matière de SEP ciblée avec des peptides étalons internes marqués par des isotopes stables, l’approche de référence pour la quantification des protéines dans le fluide biologique, ce qui se traduira par une robustesse, une sensibilité et une analyse multiplex élevées10.

-Analyse des données croisées L'équipe gérera, analysera et intégrera de manière centralisée les ensembles de données cliniques et biologiques et les connaissances générées par l'IRM et l'analyse des échantillons biologiques pour identifier une signature globale liée à la CP chez les patients LHIPFOLD. Avec ces données, l'équipe établira un score de dysfonctionnement de CP à utiliser dans la pratique clinique de routine, destiné à être utilisé pour explorer la CP chez les patients neurologiques.