Choroid Plexus-disfunctie bij neurologische aandoeningen (PLEXFOLD)

Cerebrale foliumzuurdeficiëntie (CFD) is een aandoening die wordt gedefinieerd door een lage concentratie (<41 nM) van 5-methyltetrahydrofolaat (5MTHF, de biologisch actieve vorm van foliumzuur) in het hersenvocht (CSF) 1. CFD wordt als ‘primair’ beschouwd. De oorsprong ervan is als het verband houdt met verschillende genetische ziekten waarbij het foliumzuurmetabolisme betrokken is, wat leidt tot ernstige motorische en cognitieve verschijnselen. CFD kan ook ‘secundair’ zijn, d.w.z. geassocieerd met verschillende bepaalde ziekten, zoals genetische mitochondriale ziekten en ook niet-geïdentificeerde ziekten. Bij secundaire CFD wordt de oorzaak van CFD niet begrepen. In het centrum identificeerde het team 16 CFD-patiënten met gemeenschappelijke kenmerken: diepe secundaire CFD (5MTHF<10nM terwijl foliumzuur in het bloed normaal is), eiwitrijk CSF >1g/L (N<0,5) en een specifieke betrokkenheid van de witte stof in de hersenen. hyperintensief op T2-gewogen MRI. Het team noemde dit syndroom "LHIPFOLD" voor leuko-encefalopathie met CSF HIgh Protein en FOLate-deficiëntie (vertrouwelijk, geplande indiening eind 2022). Binnen het Franse netwerk van metabolische biochemielaboratoria identificeerde het team zes extra LHIPFOLDpat (LHIPFOLD-patiënten). Ze hebben een gemiddelde leeftijd van 42 tot 14 jaar (min. 15; max. 77) en een geslachtsverhouding van 1,8 (m/v). 9/22 had ofwel een grote mitochondriale DNA-deletie (Kearns-Sayre) of bi-allelische POLG-mutaties (mitochondriaal DNA-replicatiedefect). Van de andere 13 patiënten was tot voor kort geen diagnose gesteld, maar het team vond in een onderzoekscontext en valideerde in vitro bi-allelische varianten bij 4/7 geteste patiënten binnen genen uit de MRPS-familie, die coderen voor subeenheden van het mitoriobosoom.

LHIPFOLD-patiënten hebben duidelijk een defect in het intracerebrale 5MTHF-transport, maar zonder mutatie van de foliumzuurtransporters in de hersenen. Omdat folaat uitsluitend vanuit het bloed naar de hersenen wordt getransporteerd door de choroïde plexus (CP)2, veronderstelt het team dat CFD in LHIPFOLD te wijten is aan CP-disfunctie. CP, gelokaliseerd in de hersenventrikels, is een gevasculariseerd epitheelorgaan dat fungeert als een bloed-CSF-barrière en talloze transporters tot expressie brengt voor de overdracht van moleculen van het bloed naar de CSF en vice versa (waardoor afvalproducten uit hersencellen worden verwijderd). CP scheidt ook CSF af en brengt door CSF uitgescheiden eiwitten tot expressie die verband houden met verschillende functies3.

CSF met een hoog eiwitgehalte als gevolg van een verandering in de bloed-hersenbarrière en de gerapporteerde abnormale CP-morfologie uit hersenautopsie bij twee Kearns-Sayre-patiënten pleiten ook voor CP-disfunctie bij LHIPFOLD 4. Bovendien vond het team in twee LHIPFOLDpat zeer hoge concentraties van CSF-siaalzuur zonder de betrokkenheid van siaalzuurgerelateerde genen, terwijl CP de siaalzuur-effluxtransporter sterk tot expressie brengt. Het team heeft onlangs ook een sterk verminderde CP-grootte gemeten na automatische segmentatie in twee andere LHIPFOLD-pat. Al deze gegevens pleiten sterk voor CP-disfunctie bij LHIPFOLD.

Als de hypothese juist is, betekent dit dat er naast CFD waarschijnlijk ook andere afwijkingen aan het hersenvocht bestaan ​​als gevolg van gegeneraliseerde CP-disfunctie. Dit kan zeer interessant zijn in termen van therapeutische aanpak, omdat foliumzuursuppletie een duidelijk maar beperkt therapeutisch effect heeft, vooral bij sommige patiënten. Om onze hypothese te beoordelen is er helaas geen beschikbare klinische verkenning om CP-functies te evalueren, terwijl CP-disfunctie/-verandering wordt gesuggereerd als een potentiële bijdrager aan de pathogenese bij verschillende veelvoorkomende neurologische ziekten (voor de volgende tekst zal het team disfunctie gebruiken voor zowel disfunctie als verandering ). Omdat het team denkt dat bij LHIPFOLD de CP-disfunctie bijzonder ernstig is, zoals gesuggereerd door de diepe CFD, beschouwt het team het LHIPFOLD-syndroom als een zeer nuttig klinisch model om de capaciteit van enkele relevante diagnostische hulpmiddelen om de CP-functie te evalueren te valideren. Daarom zijn de doelstellingen van het project:

1. Bewijs CP-disfunctie in LHIPFOLD, door de identificatie van specifieke en CP-gerelateerde MRI en biochemische handtekeningen, met behulp van CP-gecentreerde beeldvorming en metabolomics en proteomics-benaderingen.
2. Identificeer CP-gerelateerde biochemische biomarkers in LHIPFOLD die direct vatbaar zijn voor behandeling.
3. Opzetten van beeldvormende en biochemische diagnostische tests voor het evalueren van de CP-functie in de klinische praktijk (op biomarkers gebaseerde CP-disfunctiescore).

Methodologie Om de doelstellingen te bereiken zal het team een ​​monocentrische diagnostische fase 1 patiënt-controle studie uitvoeren, gebaseerd op beschrijvende, deterministische statistische en multidimensionale clusteringbenaderingen, ondersteund door complementaire diagnostische hulpmiddelen die specifiek zijn ontworpen voor CP-verkenning van LHIPFOLDpat versus gezonde vrijwilligers (HV) en neurologische controlepatiënten (NCpat). NCpat zal worden gebruikt om de specificiteit van de CP-gerelateerde handtekeningen te beoordelen die in LHIPFOLDpat zijn geïdentificeerd. Het team verwacht dat de bevindingen bij sommige NCpats vergelijkbaar zullen zijn met HV, maar bij andere een lichte tot matige CP-disfunctie zullen weerspiegelen. Met AP-HP als sponsor van het onderzoek zal het team goedkeuring verkrijgen van de Research Ethics Committee voor een "Jardé 1"-onderzoek, in overeenstemming met de geldende wet- en regelgevingsvereisten.

- Selectie en rekrutering van patiënten en controles. Proefpersonen zullen prospectief worden gerekruteerd gedurende een periode van twee jaar: 1) LHIPFOLDpat zal worden geselecteerd zoals eerder beschreven; 2)HV wordt gerekruteerd via de gebruikelijke advertentieprocedure en wordt gematcht op leeftijd en geslacht met LHIPFOLDpat; 3) NCpat zal bestaan ​​uit op leeftijd en geslacht afgestemde patiënten met bepaalde veelvoorkomende hersenziekten die vaak worden onderzocht op de afdeling Neurologie: multiple sclerose, amyotrofische laterale sclerose, de ziekte van Alzheimer, frontotemporale dementie, idiopathische intracraniale hypertensie en normale druk hydrocephalus. De diagnose van deze ziekten zal worden gesteld volgens de nieuwste richtlijnen door de neurologen die gespecialiseerd zijn in elke ziekte. Wat betreft de te recruteren steekproef hield het team rekening met twee beperkingen: het aantal LHIPFOLDpat is beperkt; de studie is geen eenvoudige deterministische vergelijking met een controlegroep, maar meer een multidimensionale analyse die leidt tot de identificatie van CP-gerelateerde kenmerken via homogene patiëntenclusters. Bijgevolg was de strategie het identificeren van een globale steekproefomvang die zou leiden tot een homogene classificatie van patiënten op basis van 5 of 6 biomarkers. Volgens de formule van Donicar5 zouden 2^6 patiënten die correct zijn geselecteerd door middel van een gestratificeerde steekproeftechniek dit mogelijk moeten maken. Onder deze 64 patiënten bevinden zich 15 LHIPFOLDpat-patiënten en een gelijk aantal 25 HV- en 25 NCpat-patiënten. Bovendien biedt deze steekproefomvang, door de deterministische benadering te behouden en gebaseerd op een simulatiestudie waarin gemiddelde en standaarddeviatie van CSF 5MTHF in LHIPFOLDpat en NCpat (respectievelijk 3,85 +/- 2,67 en 49,53 +/- 13,35) met respectievelijk 15 en 25 proefpersonen worden geïntegreerd, een vermogen groter dan 95% om een ​​verschil aan te tonen met een Wilcoxon Rank Sum-test tussen deze twee groepen (let op: waarden in HV zijn momenteel onbekend).

Het team zal MRI-gegevens van de hersenen (met injectie van bloedgadolinium), bloed- en hersenvochtmonsters van alle proefpersonen verzamelen. LHIPFOLDpat en NCpat zullen deze procedures ondergaan als onderdeel van de standaardzorg op de afdeling Neurologie van het Pitié-Salpêtrière-ziekenhuis. HV zal op een dag in ons Klinisch Onderzoekscentrum worden opgenomen. Alle proefpersonen zullen geïnformeerde toestemming ondertekenen en ermee instemmen een MRI-onderzoek en bloed- en hersenvochtmonsters te ondergaan voor onderzoeksdoeleinden voor HV, en aanvullende MRI-tijdverwerving en monstervolumes voor patiënten.

• Hersen-MRI-onderzoek Hersen-MRI zal worden uitgevoerd bij 3 TESLA (Siemens PRISMA) bij het Centre for Neuroimaging Research (CENIR), het beeldvormingsplatform van het Paris Brain Institute (ICM). Het team zal zowel de CP-morfologie als de functie beoordelen: 1/voor CP-morfologische analyse zal het team CP-volumes meten en textuurparameters extraheren. CP-segmentatie zal worden uitgevoerd met behulp van geautomatiseerde software die op de locatie is ontwikkeld. Textuuranalyse zal worden uitgevoerd met behulp van de MP2RAGE MRI-sequentie. 2/CP-functiebeoordeling omvat kwantitatieve metingen van de capillaire permeabiliteit en macrovasculaire perfusie. Om de CP-permeabiliteit te onderzoeken zal een dynamische T1-perfusiesequentie met gadoliniumverbetering worden gebruikt; t-TRANS en andere regionale waarden zullen worden geëxtraheerd. De nabewerking wordt uitgevoerd met behulp van Syngovia (Siemens) software. Om CP-macrovasculaire perfusie te onderzoeken, zal het team een ​​kortere versie gebruiken van de eerder gepubliceerde dynamische Arterial Spin Labeling-perfusie (zonder gadolinium). Met deze reeks kan het team de arteriële transittijd en de schijnbare bloedstroom beoordelen. Data-analyse zal worden uitgevoerd bij CENIR.
• Ontdekking van biomarkerkandidaten voor CP-disfunctie in hersenvocht/bloedcompartimenten Er zullen twee gemengde benaderingen worden gebruikt om de top 10 biomarkerkandidaten (a priori 5 metabolieten en 5 eiwitten) te selecteren die zullen worden onderzocht door middel van een gerichte en volledig kwantitatieve analyse: i) ongerichte metabolomics en proteomics (de bevindingen zullen worden beoordeeld om een ​​mogelijk verband met CP-functie te beoordelen); en ii) op ​​hypothesen gebaseerde aanpak: naast 5MTHF identificeerde het team, op basis van gegevens uit de literatuur en publiekelijk beschikbare biologische databases, ook metabolieten (waaronder ascorbinezuur en siaalzuur) die specifiek door de CP lijken te worden getransporteerd, en eiwitten specifiek uitgedrukt door de CP (inclusief TRPM3 en Klotho). Omdat bloedconcentraties voor sommige moleculen de CSF-concentraties kunnen beïnvloeden, is het team van plan om bloed en CSF tegelijkertijd te analyseren, met berekening van een CSF/Bloed-verhouding van concentraties.

Voor niet-gerichte metabolomics zullen metabolische extracten van CSF- en plasmamonsters worden verkregen na methanol-ondersteunde eiwitprecipitatie en worden geanalyseerd door vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge resolutie massaspectrometrie (LC-HRMS), zoals het team routinematig uitvoert. 7. Een combinatie van twee complementaire LC- HRMS-platforms zullen worden gebruikt om zowel hydrofobe als polaire metabolieten te profileren8. Voorbehandeling van gegevens en statistische analyses zullen worden bereikt door gebruik te maken van Workflow4Metabolomics (W4M), een open-source online samenwerkingsplatform voor computationele metabolomics. Annotatie van datasets en identificatie van biologisch relevante signalen zullen worden uitgevoerd door gebruik te maken van 'in-house' spectrale bibliotheken en MS/MS (tandem massaspectrometrie) experimenten. Relatieve kwantificering van ~250 metabolieten zal worden bereikt dankzij normalisatie met behulp van kwaliteitscontrolemonsters. Voor gerichte metabolomics wordt CSF 5MTHF routinematig gemeten in het Necker-laboratorium gespecialiseerd in neurometabolisme, met behulp van zeer gevoelige en specifieke analytische methoden (vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem-MS). Het team is bezig om in dezelfde run ascorbinezuur- en siaalzuurmaatregelen op te nemen. Afhankelijk van de chemische aard van de kandidaten voor metabolietbiomarkers die in de niet-gerichte studie zijn geïdentificeerd, zullen één of enkele nieuwe methoden voor robuuste kwantificering met behulp van stabiele isotopen worden ontwikkeld.

Een voorlopig proteomisch onderzoek naar het hersenvocht van een patiënt met een hoog gehalte aan hersenvocht en een controle zal ons in staat stellen een monstervoorbereidingsprotocol op te stellen, een massaspectrometrie-analysemethode te selecteren en een workflow voor gegevensanalyses uit te voeren. Het doel is tweeledig: de extractie van eiwitten optimaliseren en de vergelijking van zeer verschillende CSF's mogelijk maken om een ​​analytische strategie te ontwikkelen die ons in staat zal stellen biomarkers te identificeren. Het onderzoek zal worden uitgevoerd met behulp van een labelvrije aanpak om de variabiliteit en het aantal stappen te minimaliseren en vooral om het dynamische bereik van het monster niet te beperken. Alle bio-informatica-analyses zullen worden uitgevoerd met myProMS9, onze proteomische databeheer- en analysesoftware ontwikkeld aan het Institut Curie in samenwerking met het INSERM U900 bio-informaticaplatform onder leiding van Dr. E. Barillot. Voor de gerichte proteomische benadering zal het team gebruik maken van de expertise op het gebied van gerichte MS met stabiele isotoopgelabelde interne standaardpeptiden, de gouden standaardbenadering voor eiwitkwantificering in biologische vloeistof, resulterend in hoge robuustheid, hoge gevoeligheid en multiplexanalyse10.

-Cross-data-analyse Het team zal klinische en biologische datasets en kennis gegenereerd door de MRI en de analyse van biologische monsters centraal beheren, analyseren en integreren om een ​​globale CP-gerelateerde signatuur bij LHIPFOLD-patiënten te identificeren. Met deze gegevens zal het team een ​​CP-dysfunctiescore vaststellen voor gebruik in de routinematige klinische praktijk, bedoeld om te worden gebruikt om CP bij neurologische patiënten te onderzoeken.