Choroid plexus diszfunkció neurológiai betegségekben (PLEXFOLD)

Az agyi foláthiány (CFD) egy olyan állapot, amelyet az 5-metil-tetrahidrofolát (5MTHF, a folát biológiailag aktív formája) alacsony koncentrációja (<41 nM) határoz meg a cerebrospinális folyadékban (CSF) 1. A CFD „elsődlegesnek” tekinthető. eredete, ha több, folsavanyagcserével járó genetikai betegséggel jár együtt, ami súlyos motoros és kognitív megnyilvánulásokhoz vezet. A CFD „másodlagos” is lehet, azaz különféle meghatározott betegségekkel, például genetikai mitokondriális betegségekkel és azonosítatlan betegségekkel is összefüggésbe hozható. Másodlagos CFD esetén a CFD oka nem ismert. A központban a csapat 16 CFD-s beteget azonosított, akiknek közös jellemzői: mély másodlagos CFD (5MTHF<10 nM, míg a vér folát normális), magas fehérje CSF >1g/l (N<0,5), és az agy fehérállományának specifikus érintettsége. hiperintenzív a T2 súlyozott MRI-n. A csapat ezt a szindrómát "LHIPFOLD"-nak nevezte a magas CSF-fehérje- és foláthiányos leukoencephalopathia miatt (bizalmas, 2022 végén várhatóan benyújtják). A francia metabolikus biokémiai laborhálózaton belül a csapat további 6 LHIPFOLDpat-t (LHIPFOLD beteget) azonosított. Átlagéletkoruk 42-14 év (min 15; max 77), ivararányuk 1,8 (M/F). 9/22-ben vagy nagy mitokondriális DNS-deléció (Kearns-Sayre), vagy bi-allél POLG mutáció (mitokondriális DNS-replikációs hiba) volt. A többi 13 beteget a közelmúltig nem diagnosztizálták, de a kutatócsoport kutatási kontextusban talált és validált in vitro bi-allél variánsokat 4/7 tesztelt betegnél a mitoriboszóma alegységeit kódoló MRPS család génjein belül.

Az LHIPFOLD betegeknél egyértelműen az intracerebrális 5MTHF transzport hibája van, de az agy folát transzportereinek mutációja nélkül. Mivel a folátot kizárólag a plexus choroid plexus (CP)2 szállítja a vérből az agyba, a csapat azt feltételezi, hogy az LHIPFOLD-ban a CFD a CP diszfunkciójának köszönhető. A CP, amely az agykamrákban lokalizálódik, egy vaszkularizált hámszerv, amely vér-CSF gátként működik, számos transzportert expresszál a vérből a CSF-be és fordítva (eltávolítja a salakanyagokat az agysejtekből). A CP CSF-et is szekretál, és különböző funkciókhoz kapcsolódó CSF által kiválasztott fehérjéket expresszál3.

A vér-agy gát változása miatti magas fehérje CSF, valamint két Kearns-Sayre-betegnél az agy boncolásából származó abnormális CP morfológiáról számoltak be, amelyek szintén a CP diszfunkció mellett állnak a LHIPFOLD 4-ben. Ezenkívül két LHIPFOLDpat vizsgálatban a csapat nagyon magas koncentrációban talált A CSF sziálsav sziálsavval rokon gének bevonása nélkül, míg a CP erősen expresszálja a sziálsav efflux transzportert. A csapat nemrégiben erősen csökkent CP-méretet is mért az automatikus szegmentációt követően két másik LHIPFOLD-pattanásban. Mindezek az adatok erősen a CP diszfunkció mellett szólnak az LHIPFOLD-ban.

Ha a hipotézis helyes, az azt jelenti, hogy a CFD-n kívül valószínűleg egyéb CSF-rendellenességek is léteznek a generalizált CP diszfunkció következményeként. Ez nagyon érdekes lehet a terápiás megközelítés szempontjából, mivel a folát-kiegészítés egyértelmű, de korlátozott terápiás hatással bír, különösen egyes betegeknél. Hipotézisünk értékeléséhez sajnos nem áll rendelkezésre klinikai feltárás a CP-funkciók értékelésére, míg a CP diszfunkció/elváltozás lehetséges patogenezis hozzájárulója lehet számos gyakori neurológiai betegségben (a következő szövegben a csapat a diszfunkciót diszfunkcióra és elváltozásra egyaránt felhasználja ). Mivel a csapat úgy gondolja, hogy LHIPFOLD-ban a CP-diszfunkció különösen súlyos, amint azt a mély CFD is sugallja, a csapat az LHIPFOLD-szindrómát nagyon hasznos klinikai modellnek tekinti egyes releváns diagnosztikai eszközök CP-funkció értékelésére való képességének igazolására. Ezért a projekt céljai a következők:

1. Bizonyítsa be a CP diszfunkciót az LHIPFOLD-ban specifikus és CP-vel kapcsolatos MRI és biokémiai aláírások azonosításával, CP-központú képalkotás, metabolomikai és proteomikai megközelítések segítségével.
2. Azonosítsa a CP-vel kapcsolatos biokémiai biomarkereket az LHIPFOLD-ban, amelyek közvetlenül kezelhetők.
3. Képalkotó és biokémiai diagnosztikai tesztek a CP funkció klinikai gyakorlatban történő értékelésére (biomarker alapú CP-diszfunkció pontszám).

Módszertan A célok elérése érdekében a csapat monocentrikus diagnosztikai fázis 1 eset-kontroll vizsgálatot végez, amely leíró, determinisztikus statisztikai és többdimenziós klaszterezési megközelítésen alapul, amelyet kiegészítő diagnosztikai eszközök támogatnak, amelyeket kifejezetten az LHIPFOLDpat és az egészséges önkéntesek (HV) CP feltárására terveztek. neurológiai kontroll betegek (NCpat). Az NCpat az LHIPFOLDpat-ban azonosított CP-vel kapcsolatos aláírások specifikusságának értékelésére szolgál. A csapat arra számít, hogy a leletek hasonlóak lesznek a HV-hez néhány NCpat esetében, de más esetekben enyhe vagy közepes CP diszfunkciót tükröznek. Ha az AP-HP a vizsgálat szponzora, a csapat megkapja a Kutatási Etikai Bizottság jóváhagyását a "Jardé 1" vizsgálathoz, a hatályos jogszabályoknak és szabályozási követelményeknek megfelelően.

-Betegek és kontrollok kiválasztása és toborzása Az alanyokat egy kétéves időszak alatt jövőre toborozzák: 1)LHIPFOLDpat a korábban leírtak szerint kerül kiválasztásra; 2) A HV-t a szokásos hirdetési eljárással veszik fel, és a LHIPFOLDpat segítségével kor és nem szerint egyeztetik; 3) Az NCpat életkornak és nemnek megfelelő, a neurológiai osztályon gyakran feltárt gyakori agyi betegségekben szenvedő betegek: sclerosis multiplex, amyotrophiás laterális szklerózis, Alzheimer-kór, frontotemporális demencia, idiopátiás intracranialis hypertonia és normál nyomású hydrocephalus. Ezen betegségek diagnosztizálását az egyes betegségekre szakosodott neurológusok a legújabb irányelvek szerint végzik. A toborozandó mintával kapcsolatban a csapat két korlátot vett figyelembe: az LHIPFOLDpat száma korlátozott; a tanulmány nem egy egyszerű determinisztikus összehasonlítás a kontrollcsoporttal, hanem egy többdimenziós elemzés, amely a CP-vel kapcsolatos aláírások azonosításához vezet homogén betegcsoportokon keresztül. Következésképpen a stratégia egy olyan globális mintanagyság meghatározása volt, amely a betegek homogén osztályozását eredményezi 5 vagy 6 biomarker alapján. Donicar képlete5 szerint 2^6 rétegzett mintavételi technikával megfelelően kiválasztott betegnek kell ezt lehetővé tennie. Ebben a 64 betegben 15 LHIPFOLDpat és azonos számú 25 HV és 25 NCpat lesz. Továbbá, a determinisztikus megközelítést megtartva, és a CSF 5MTHF átlagát és szórását integráló szimulációs vizsgálat alapján LHIPFOLDpat és NCpat (3,85 +/- 2,67 és 49,53 +/- 13,35) 15, illetve 25 alany esetében ez a mintaméret 95%-nál nagyobb teljesítmény a különbség kimutatására Wilcoxon Rank Sum teszttel e két csoport között (megjegyzendő, a HV értékek jelenleg nem ismertek).

A csapat agyi MRI-adatokat (vér-gadolínium injekcióval), vér- és CSF-mintákat fog szerezni minden alanytól. A LHIPFOLDpat és az NCpat a Pitié-Salpêtrière Kórház Neurológiai Osztályán a szokásos ellátás részeként átesik ezeken az eljárásokon. A HV egy napon kórházba kerül a Klinikai Kivizsgáló Központunkban. Minden alany aláírja a tájékozott beleegyezését, és beleegyezik abba, hogy MRI-vizsgálaton, vér- és CSF-mintavételen vesz részt kutatási célból HV-vel, valamint további MRI-felvételi idővel és mintamennyiséggel a betegek számára.

• Agyi MRI-vizsgálat Az agyi MRI-t a 3 TESLA-ban (Siemens PRISMA) végzik a Neuroimaging Research Center (CENIR), a Paris Brain Institute (ICM) képalkotó platformján. A csapat felméri a CP morfológiáját és funkcióját is: 1/a CP morfológiai elemzéséhez a csapat méri a CP térfogatát és kivonja a texturális paramétereket. A CP szegmentálása a helyszínen kifejlesztett automatizált szoftverrel történik. A textúraelemzés az MP2RAGE MRI szekvencia használatával történik. A 2/CP funkcióértékelés magában foglalja a kapilláris permeabilitás és a makrovaszkuláris perfúzió kvantitatív mérését. A CP permeabilitásának feltárására dinamikus T1 perfúziós szekvenciát használnak gadolínium fokozással; A t-TRANS és egyéb regionális értékek kinyerésre kerülnek. Az utófeldolgozás a Syngovia (Siemens) szoftverrel történik. A CP makrovaszkuláris perfúziójának felderítésére a csapat a dinamikus Arterial Spin Labeling perfúzió rövidebb változatát fogja használni (gadolínium nélkül), amely korábban megjelent 6. Ezzel a sorozattal a csapat képes lesz értékelni az artériás áthaladási időt és a látszólagos véráramlást. Az adatok elemzése a CENIR-ben történik.
• A CP diszfunkciós biomarker jelöltek felfedezése a CSF-ben/vérrekeszekben Két vegyes megközelítést alkalmaznak a 10 legjobb biomarker jelölt (a priori 5 metabolit és 5 fehérje) kiválasztására, amelyeket célzott és teljesen kvantitatív analízissel vizsgálnak meg: i) nem célzott metabolomika és proteomika (a megállapításokat felülvizsgálják a CP funkcióval való lehetséges kapcsolat felmérése érdekében); és ii) hipotézis-vezérelt megközelítés: az 5MTHF mellett a szakirodalomból és a nyilvánosan elérhető biológiai adatbázisból származó adatok alapján a csapat olyan metabolitokat is azonosított (beleértve az aszkorbinsavat és sziálsavat), amelyeket úgy tűnik, hogy kifejezetten a CP szállít, valamint fehérjéket. kifejezetten a CP által kifejezett (beleértve a TRPM3-at és a Klotho-t). Mivel a vér koncentrációja befolyásolhatja egyes molekulák CSF-koncentrációját, a csapat azt tervezi, hogy egyidejűleg elemzi a vért és a CSF-mintát, a CSF/vér koncentrációk arányának kiszámításával.

A nem célzott metabolomika érdekében a CSF és a plazma minták metabolikus kivonatait metanollal segített fehérjekicsapást követően nyerjük ki, és folyadékkromatográfiával, nagy felbontású tömegspektrometriával (LC-HRMS) elemezzük, ahogy a csapat rutinszerűen elvégzi a 7. Két egymást kiegészítő LC- A HRMS platformokat mind a hidrofób, mind a poláris metabolitok profilálására fogják használni8. Az adatok előkezelését és statisztikai elemzését a Workflow4Metabolomics (W4M) használatával érik el, amely egy nyílt forráskódú kollaboratív online platform a számítási metabolomikához. Az adatsorok annotálása és a biológiailag releváns jelek azonosítása „házon belüli” spektrális könyvtárak, valamint MS/MS (tandem tömegspektrometria) kísérletekkel történik. A minőség-ellenőrző minták segítségével történő normalizálásnak köszönhetően ~250 metabolit relatív mennyiségi meghatározása érhető el. A célzott metabolomikához a CSF 5MTHF-et rutinszerűen mérik a neurometabolizmusra szakosodott Necker laboratóriumban, nagyon érzékeny és specifikus analitikai módszerekkel (folyadékkromatográfia tandem MS-re kötőjellel). A csapat azon dolgozik, hogy ugyanabba az aszkorbinsav- és sziálsav-mérést is belefoglalják. A nem célzott vizsgálatban azonosított metabolit biomarker jelöltek kémiai természetétől függően egy vagy néhány új módszert fejlesztenek ki a stabil izotópokat használó robusztus mennyiségi meghatározásra.

A magas CSF-fehérjével rendelkező páciens CSF-jén végzett előzetes proteomikai vizsgálat és egy kontroll lehetővé teszi számunkra, hogy felállítsunk egy minta-előkészítési protokollt, válasszunk tömegspektrometriás elemzési módszert és adatelemzési munkafolyamatot. A cél kettős: optimalizálni a fehérjék kivonását, és lehetővé tenni a nagyon különböző CSF-ek összehasonlítását egy olyan analitikai stratégia kidolgozása érdekében, amely lehetővé teszi számunkra a biomarkerek azonosítását. A vizsgálatot címkementes megközelítéssel végezzük, hogy minimalizáljuk a változékonyságot, a lépések számát, és különösen ne korlátozzuk a minta dinamikus tartományát. Minden bioinformatikai elemzés a myProMS9-cel, a proteomikai adatkezelő és elemző szoftverünkkel történik, amelyet az Institut Curie-ben fejlesztettek ki a Dr. E. Barillot által irányított INSERM U900 bioinformatikai platformmal együttműködésben. A célzott proteomikai megközelítéshez a csapat felhasználja a célzott SM-re vonatkozó szakértelmét stabil izotóppal jelzett belső standard peptidekkel, az arany standard megközelítést a fehérje mennyiségi meghatározására a biológiai folyadékban, ami nagy robusztusságot, nagy érzékenységet és multiplex elemzést eredményez10.

- Keresztes adatok elemzése A csapat központilag kezeli, elemzi és integrálja az MRI és biológiai minták elemzése során előállított klinikai és biológiai adatkészleteket és ismereteket, hogy azonosítsa a globális CP-vel kapcsolatos aláírást az LHIPFOLD betegekben. Ezekkel az adatokkal a csapat megállapítja a CP-diszfunkció pontszámát a rutin klinikai gyakorlatban való használatra, amelyet a neurológiai betegek CP feltárására kívánnak használni.