Choroid Plexus Dysfunktion ved neurologiske sygdomme (PLEXFOLD)

Cerebral folatmangel (CFD) er en tilstand defineret ved lav koncentration (<41 nM) af 5-methyltetrahydrofolat (5MTHF, den biologisk aktive form af folat) i cerebrospinalvæsken (CSF) 1. CFD anses for at være af "primær" oprindelse, hvis det er forbundet med flere genetiske sygdomme, der involverer folatmetabolisme, hvilket fører til alvorlige motoriske og kognitive manifestationer. CFD kan også være "sekundær", dvs. forbundet med forskellige bestemte sygdomme såsom genetiske mitokondrielle sygdomme og også uidentificerede sygdomme. I sekundær CFD er årsagen til CFD ikke forstået. I midten identificerede holdet 16 CFD-patienter med fælles karakteristika: dyb sekundær CFD (5MTHF<10nM, hvorimod folat i blodet er normalt), højprotein-CSF >1g/L (N<0,5) og en specifik involvering af hvidt stof i hjernen, hyperintens på T2-vægtet MR. Holdet kaldte dette syndrom "LHIPFOLD" for leukoencefalopati med CSF HIgh Protein and FOLate Deficiency (fortroligt, planlagt indsendelse i slutningen af ​​2022). Inden for det franske netværk af metaboliske biokemiske laboratorier identificerede holdet 6 yderligere LHIPFOLDpat (LHIPFOLD-patienter). De har en gennemsnitsalder på 42 til 14 år (min 15; max 77) og et kønsforhold på 1,8 (M/K). 9/22 havde enten en stor mitokondriel DNA-deletion (Kearns-Sayre) eller bi-alleliske POLG-mutationer (mitokondriel DNA-replikationsdefekt). De andre 13 patienter var alle udiagnosticeret indtil for nylig, men holdet fandt i en forskningssammenhæng og validerede in vitro bi-alleliske varianter i 4/7 testede patienter inden for gener fra MRPS-familien, der koder for underenheder af mitoribosomet.

LHIPFOLD-patienter har tydeligvis en defekt af intracerebral 5MTHF-transport, men uden mutation af hjernens folattransportører. Da folat udelukkende transporteres fra blod til hjernen af ​​choroid plexus (CP)2, antager teamet, at CFD i LHIPFOLD skyldes CP-dysfunktion. CP, lokaliseret i hjerneventriklerne, er et vaskulariseret epitelorgan, der fungerer som en blod-CSF-barriere, der udtrykker talrige transportører for molekyler, der overføres fra blodet til CSF og omvendt (fjerner affaldsprodukter fra hjerneceller). CP udskiller også CSF og udtrykker CSF-udskilte proteiner relateret til forskellige funktioner3.

CSF med højt proteinindhold på grund af en ændring af blod-hjernebarrieren og rapporteret unormal CP-morfologi fra hjerneobduktion hos to Kearns-Sayre-patienter er også tilhængere af CP-dysfunktion i LHIPFOLD 4. Derudover fandt holdet meget høje koncentrationer af LHIPFOLD 4. CSF sialinsyre uden involvering af sialinsyre-relaterede gener, hvorimod CP stærkt udtrykker sialinsyre efflux transporteren. Holdet målte også for nylig stærkt reduceret CP-størrelse efter automatisk segmentering i to andre LHIPFOLD pat. Alle disse data argumenterer stærkt for CP-dysfunktion i LHIPFOLD.

Hvis hypotesen er korrekt, betyder det, at der ud over CFD sandsynligvis eksisterer andre CSF-abnormiteter som følge af generaliseret CP-dysfunktion. Dette kan være meget interessant i forhold til terapeutisk tilgang, da folattilskud har en klar, men begrænset terapeutisk effekt, især hos nogle patienter. For at vurdere vores hypotese er der desværre ingen tilgængelig klinisk udforskning til at evaluere CP-funktioner, hvorimod CP-dysfunktion/-ændring foreslås som en potentiel patogenese-bidragsyder i flere almindelige neurologiske sygdomme (i den følgende tekst vil teamet bruge dysfunktion til både dysfunktion og ændring ). Da teamet mener, at CP-dysfunktionen i LHIPFOLD er særlig alvorlig, som antydet af den dybe CFD, betragter teamet LHIPFOLD-syndrom som en meget nyttig klinisk model til at validere kapaciteten af ​​nogle relevante diagnostiske værktøjer til at evaluere CP-funktionen. Derfor er formålet med projektet:

1. Bevis CP-dysfunktion i LHIPFOLD gennem identifikation af specifikke og CP-relaterede MRI og biokemiske signaturer, ved hjælp af CP-centreret billeddannelse og metabolomics og proteomics tilgange.
2. Identificer CP-relaterede biokemiske biomarkører i LHIPFOLD, der er direkte modtagelige for behandling.
3. Opsætning af billeddannelse og biokemiske diagnostiske tests til evaluering af CP-funktion i klinisk praksis (biomarkørbaseret CP-dysfunktionsscore).

Metode For at nå målene vil teamet udføre et monocentrisk diagnostisk fase 1 case-kontrol studie, baseret på deskriptiv, deterministisk statistisk og multidimensionel klyngetilgang, understøttet af komplementære diagnostiske værktøjer specielt designet til CP-udforskning af LHIPFOLDpat versus raske frivillige (HV) og neurologiske kontrolpatienter (NCpat). NCpat vil blive brugt til at vurdere specificiteten af ​​de CP-relaterede signaturer identificeret i LHIPFOLDpat. Holdet forventer, at resultaterne vil ligne HV i nogle NCpat, men vil afspejle let til moderat CP-dysfunktion i andre. Med AP-HP som studiesponsor vil teamet opnå godkendelse af den forskningsetiske komité til en "Jardé 1" undersøgelse i overensstemmelse med gældende lovgivning og regulatoriske krav.

-Patient- og kontroludvælgelse og rekruttering. Emner vil blive rekrutteret prospektivt i løbet af en to-årig periode: 1)LHIPFOLDpat vil blive udvalgt som tidligere beskrevet; 2)HV vil blive rekrutteret efter den sædvanlige annonceringsprocedure og vil blive matchet for alder og køn med LHIPFOLDpat; 3) NCpat vil være alders- og kønsmatchede patienter med tydelige almindelige hjernesygdomme, der hyppigt udforskes i Neurologisk afdeling: multipel sklerose, amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sygdom, frontotemporal demens, idiopatisk intrakraniel hypertension og normalt tryk hydrocephalus. Diagnosen af ​​disse sygdomme vil blive stillet i henhold til de nyeste retningslinjer af neurologer, der er specialiseret i hver sygdom. Med hensyn til prøven, der skulle rekrutteres, tog holdet hensyn til to begrænsninger: antallet af LHIPFOLDpat er begrænset; undersøgelsen er ikke en simpel deterministisk sammenligning vs en kontrolgruppe, men mere en multidimensionel analyse, der fører til identifikation af CP-relaterede signaturer gennem homogene patientklynger. Strategien var derfor at identificere en global stikprøvestørrelse, der ville føre til en homogen klassificering af patienter baseret på 5 eller 6 biomarkører. Ifølge Donicars formel5 skal 2^6 patienter, der er korrekt udvalgt ved en stratificeret prøvetagningsteknik, tillade dette. Disse 64 patienter vil omfatte 15 LHIPFOLDpat og et lige antal 25 HV og 25 NCpat. Ved at fastholde den deterministiske tilgang og baseret på en simuleringsundersøgelse, der integrerer middelværdi og standardafvigelse af CSF 5MTHF i LHIPFOLDpat og NCpat (henholdsvis 3,85 +/- 2,67 og 49,53 +/- 13,35) med henholdsvis 15 og 25 forsøgspersoner, giver denne prøvestørrelse. en effekt større end 95 % for at demonstrere en forskel med en Wilcoxon Rank Sum-test mellem disse to grupper (det skal bemærkes, at værdier i HV i øjeblikket er ukendte).

Holdet vil indsamle hjerne-MR-data (med blodgadoliniuminjektion), blod- og CSF-prøver fra alle forsøgspersoner. LHIPFOLDpat og NCpat vil gennemgå disse procedurer som en del af standardbehandlingen på den neurologiske afdeling på Pitié-Salpêtrière Hospital. HV bliver indlagt en dag i vores Klinisk Udredningscenter. Alle forsøgspersoner vil underskrive informeret samtykke og accepterer at gennemgå MR-undersøgelse og blod- og CSF-prøvetagning til forskningsformål for HV, og yderligere MR-tidsopsamling og prøvevolumener for patienter.

• Hjerne-MR-studie Hjerne-MR vil blive udført på 3 TESLA (Siemens PRISMA) ved Center for Neuroimaging Research (CENIR), billeddannelsesplatformen for Paris Brain Institute (ICM). Holdet vil vurdere både CP-morfologi og funktion: 1/For CP-morfologisk analyse vil holdet måle CP-volumener og udtrække teksturparametre. CP-segmentering vil blive udført ved hjælp af automatiseret software udviklet på stedet. Teksturanalyse vil blive udført ved hjælp af MP2RAGE MRI-sekvensen. 2/CP funktionsvurdering vil omfatte kvantitative målinger af kapillær permeabilitet og makrovaskulær perfusion. For at udforske CP-permeabilitet vil dynamisk T1-perfusionssekvens med gadoliniumforstærkning blive brugt; t-TRANS og andre regionale værdier vil blive udtrukket. Efterbehandling vil blive udført ved hjælp af Syngovia (Siemens) software. For at udforske CP makrovaskulær perfusion vil holdet bruge en kortere version af den dynamiske arterielle spin-mærkning perfusion (uden gadolinium) offentliggjort tidligere 6. Med denne sekvens vil holdet være i stand til at værdsætte arteriel transittid og tilsyneladende blodgennemstrømning. Dataanalyse vil blive udført på CENIR.
• Opdagelse af CP-dysfunktion biomarkørkandidater i CSF/blodrum To blandede tilgange vil blive brugt til at udvælge de 10 bedste biomarkørkandidater (a priori 5 metabolitter og 5 proteiner), som vil blive undersøgt ved en målrettet og fuldt kvantitativ analyse: i) ikke-målrettet metabolomik og proteomics (fundene vil blive gennemgået for at vurdere en mulig sammenhæng med CP-funktion); og ii) hypotese-drevet tilgang: Ud over 5MTHF, baseret på data fra litteraturen og offentligt tilgængelig biologisk database, identificerede teamet også metabolitter (inklusive ascorbinsyre og sialinsyre), der ser ud til at blive specifikt transporteret af CP, og proteiner specifikt udtrykt af CP (herunder TRPM3 og Klotho). Da blodkoncentrationer kan påvirke CSF-koncentrationer for nogle molekyler, planlægger teamet at analysere blod og CSF-prøver på samme tid med beregning af et CSF/Blod-forhold af koncentrationer.

Til ikke-målrettet metabolomik vil metaboliske ekstrakter af CSF og plasmaprøver blive opnået efter methanol-assisteret proteinudfældning og analyseret ved væskekromatografi koblet til højopløsningsmassespektrometri (LC-HRMS), mens holdet rutinemæssigt udfører 7. En kombination af to komplementære LC- HRMS-platforme vil blive brugt til at profilere både hydrofobe og polære metabolitter8. Dataforbehandling og statistiske analyser vil blive opnået ved at bruge Workflow4Metabolomics (W4M), som er en open-source kollaborativ online platform for beregningsmæssig metabolomics. Annotering af datasæt og identifikation af biologisk relevante signaler vil blive udført ved at bruge 'in-house' spektralbiblioteker og MS/MS (tandem massespektrometri) eksperimenter. Relativ kvantificering af ~250 metabolitter vil blive opnået takket være normalisering ved hjælp af kvalitetskontrolprøver. Til målrettet metabolomik måles CSF 5MTHF rutinemæssigt i Necker-laboratorium, der er specialiseret i neurometabolisme, ved hjælp af meget følsomme og specifikke analytiske metoder (væskekromatografi bindestreger til tandem-MS). Holdet er i gang med at inkludere ascorbinsyre- og sialinsyreforanstaltninger i samme kørsel. Afhængigt af den kemiske natur af metabolitbiomarkørkandidaterne identificeret i det ikke-målrettede studie, vil en eller få nye metoder til robust kvantificering ved hjælp af stabile isotoper blive udviklet.

En foreløbig proteomisk undersøgelse af CSF af en patient med højt CSF-protein og en kontrol vil give os mulighed for at etablere en prøveforberedelsesprotokol, vælge en massespektrometrianalysemetode og dataanalyser workflow. Målet er todelt: at optimere udvindingen af ​​proteiner og at tillade sammenligning af meget forskellige CSF'er for at udvikle en analytisk strategi, der vil give os mulighed for at identificere biomarkører. Undersøgelsen vil blive udført ved at bruge en etiketfri tilgang for at minimere variabiliteten, antallet af trin og især ikke for at begrænse prøvens dynamiske område. Alle bioinformatikanalyser vil blive udført med myProMS9, vores proteomiske datastyrings- og analysesoftware udviklet på Institut Curie i samarbejde med INSERM U900 bioinformatikplatformen ledet af Dr. E. Barillot. Til den målrettede proteomiske tilgang vil teamet bruge ekspertisen om målrettet MS med stabile isotopmærkede interne standardpeptider, guldstandardtilgangen til proteinkvantificering i biologisk væske, hvilket resulterer i høj robusthed, høj følsomhed og multipleksanalyse10.

- Krydsdataanalyse Teamet vil centralt administrere, analysere og integrere kliniske og biologiske datasæt og viden genereret af MRI og biologiske prøveanalyser for at identificere en global CP-relateret signatur hos LHIPFOLD-patienter. Med disse data vil holdet etablere en CP-dysfunktionsscore til brug i rutinemæssig klinisk praksis, beregnet til at blive brugt til at udforske CP hos neurologiske patienter.