Дисфункция сосудистого сплетения при неврологических заболеваниях (PLEXFOLD)

Церебральный дефицит фолата (ЦФД) – это состояние, характеризующееся низкой концентрацией (<41 нМ) 5-метилтетрагидрофолата (5MTHF, биологически активной формы фолата) в спинномозговой жидкости (СМЖ) 1. ЦФД считается «первичным» происхождения, если он связан с несколькими генетическими заболеваниями, включающими метаболизм фолатов, приводящими к тяжелым двигательным и когнитивным проявлениям. CFD также может быть «вторичным», т.е. связанным с различными определенными заболеваниями, такими как генетические митохондриальные заболевания, а также неустановленными заболеваниями. При вторичном CFD причина CFD не ясна. В центре команда выявила 16 пациентов с CFD с общими характеристиками: глубокая вторичная CFD (5MTHF<10 нМ, тогда как фолат в крови нормальный), высокий уровень белка в спинномозговой жидкости >1 г/л (N<0,5) и специфическое поражение белого вещества головного мозга. гиперинтенсивный на Т2-взвешенной МРТ. Команда назвала этот синдром «LHIPFOLD» для лейкоэнцефалопатии с высоким содержанием белка в спинномозговой жидкости и дефицитом фолиевой кислоты (конфиденциально, представление запланировано на конец 2022 года). В сети французских лабораторий метаболической биохимии команда выявила еще 6 пациентов с LHIPFOLDpat (пациентов с LHIPFOLD). Их средний возраст от 42 до 14 лет (минимум 15; максимум 77 лет) и соотношение полов 1,8 (М/Ж). У 22 сентября была либо большая делеция митохондриальной ДНК (Кернс-Сейр), либо биаллельные мутации POLG (дефект репликации митохондриальной ДНК). Остальные 13 пациентов до недавнего времени не были диагностированы, но в ходе исследования команда обнаружила и подтвердила in vitro биаллельные варианты у 4/7 протестированных пациентов в генах семейства MRPS, кодирующих субъединицы миторибосомы.

У пациентов с LHIPFOLD явно имеется дефект внутримозгового транспорта 5MTHF, но без мутации мозговых транспортеров фолата. Поскольку фолат транспортируется из крови в мозг исключительно сосудистым сплетением (CP)2, команда выдвигает гипотезу, что CFD при LHIPFOLD обусловлен дисфункцией CP. ЦП, локализованный в желудочках головного мозга, представляет собой васкуляризированный эпителиальный орган, который действует как гемато-ликворный барьер, экспрессируя многочисленные транспортеры для переноса молекул из крови в ликвор и наоборот (удаляя продукты жизнедеятельности из клеток головного мозга). CP также секретирует CSF и экспрессирует секретируемые CSF белки, связанные с различными функциями3.

Высокий уровень белка в СМЖ из-за изменения гематоэнцефалического барьера и аномальная морфология ЦП при аутопсии головного мозга у двух пациентов Кернса-Сэйра также свидетельствуют в пользу дисфункции ЦП в LHIPFOLD 4. Кроме того, в двух LHIPFOLDpat команда обнаружила очень высокие концентрации Сиаловая кислота CSF без участия генов, связанных с сиаловой кислотой, тогда как CP сильно экспрессирует переносчик оттока сиаловой кислоты. Команда также недавно измерила сильное уменьшение размера CP после автоматической сегментации в двух других тестах LHIPFOLD. Все эти данные убедительно свидетельствуют в пользу дисфункции ЦП при LHIPFOLD.

Если гипотеза верна, это означает, что помимо CFD, вероятно, существуют и другие нарушения спинномозговой жидкости как следствие генерализованной дисфункции ЦП. Это может быть очень интересно с точки зрения терапевтического подхода, поскольку добавки фолиевой кислоты имеют явный, но ограниченный терапевтический эффект, особенно у некоторых пациентов. К сожалению, для оценки нашей гипотезы не существует доступных клинических исследований для оценки функций ЦП, тогда как дисфункция/изменение ЦП предполагается в качестве потенциального фактора патогенеза нескольких распространенных неврологических заболеваний (в следующем тексте команда будет использовать дисфункцию как для дисфункции, так и для изменения). ). Поскольку команда считает, что при LHIPFOLD дисфункция ЦП особенно серьезна, о чем свидетельствует глубокая CFD, команда считает синдром LHIPFOLD очень полезной клинической моделью для проверки способности некоторых соответствующих диагностических инструментов оценивать функцию ЦП. Таким образом, целями проекта являются:

1. Докажите дисфункцию CP в LHIPFOLD путем идентификации специфических и связанных с CP МРТ и биохимических признаков, используя CP-центрированную визуализацию, а также подходы метаболомики и протеомики.
2. Определить биохимические биомаркеры, связанные с ЦП, в LHIPFOLD, непосредственно поддающиеся лечению.
3. Проведение визуализирующих и биохимических диагностических тестов для оценки функции ЦП в клинической практике (оценка дисфункции ЦП на основе биомаркеров).

Методология Для достижения целей команда проведет моноцентрическое диагностическое исследование фазы 1 «случай-контроль», основанное на описательной, детерминированной статистике и подходе многомерной кластеризации, поддерживаемом дополнительными диагностическими инструментами, специально разработанными для исследования ХП LHIPFOLDpat по сравнению со здоровыми добровольцами (HV) и пациенты неврологического контроля (NCpat). NCpat будет использоваться для оценки специфичности сигнатур, связанных с CP, идентифицированных в LHIPFOLDpat. Команда ожидает, что результаты будут аналогичны результатам ГВ в некоторых NCpat, но будут отражать легкую или умеренную дисфункцию ЦП в других. При участии AP-HP в качестве спонсора исследования команда получит одобрение Комитета по этике исследований на исследование «Жарде 1» в соответствии с действующим законодательством и нормативными требованиями.

-Отбор и набор пациентов и контрольной группы. Субъекты будут проспективно набираться в течение двухлетнего периода: 1) LHIPFOLDpat будет выбран, как описано ранее; 2) HV будет набран с помощью обычной процедуры объявления и будет сопоставлен по возрасту и полу с помощью LHIPFOLDpat; 3) NCpat будет включать пациентов соответствующего возраста и пола с определенными распространенными заболеваниями головного мозга, часто исследуемыми в отделении неврологии: рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, лобно-височная деменция, идиопатическая внутричерепная гипертензия и гидроцефалия нормального давления. Диагноз этих заболеваний будет ставиться в соответствии с новейшими рекомендациями неврологами, специализирующимися на каждом заболевании. Что касается выборки, которую необходимо набрать, команда приняла во внимание два ограничения: количество LHIPFOLDpat ограничено; исследование представляет собой не простое детерминистическое сравнение с контрольной группой, а скорее многомерный анализ, ведущий к выявлению признаков, связанных с ДЦП, среди однородных групп пациентов. Следовательно, стратегия заключалась в определении глобального размера выборки, который привел бы к однородной классификации пациентов на основе 5 или 6 биомаркеров. Согласно формуле Доникара5, 2^6 пациентов, правильно отобранных с помощью метода стратифицированной выборки, должны это позволить. Среди этих 64 пациентов будет 15 LHIPFOLDpat и такое же количество 25 HV и 25 NCpat. Кроме того, при сохранении детерминистического подхода и на основе симуляционного исследования, объединяющего среднее и стандартное отклонение 5MTHF CSF в LHIPFOLDpat и NCpat (3,85 +/- 2,67 и 49,53 +/- 13,35 соответственно) с 15 и 25 субъектами соответственно, этот размер выборки обеспечивает степень более 95%, чтобы продемонстрировать разницу с помощью теста суммы рангов Уилкоксона между этими двумя группами (следует отметить, что значения HV в настоящее время неизвестны).

Команда получит данные МРТ головного мозга (с инъекцией гадолиния в кровь), образцы крови и спинномозговой жидкости у всех субъектов. LHIPFOLDpat и NCpat пройдут эти процедуры в рамках стандартного лечения в отделении неврологии больницы Питье-Сальпетриер. Однажды ГВ будет госпитализирован в наш Центр клинических исследований. Все субъекты подпишут информированное согласие и согласятся пройти МРТ-обследование и забор крови и спинномозговой жидкости для исследовательских целей на ВГ, а также дополнительное время МРТ и объемы образцов для пациентов.

• Исследование МРТ головного мозга МРТ головного мозга будет проводиться в 3 TESLA (Siemens PRISMA) в Центре нейровизуализационных исследований (CENIR), платформе визуализации Парижского института мозга (ICM). Команда оценит как морфологию, так и функцию CP: 1/для морфологического анализа CP команда измерит объемы CP и извлечет текстурные параметры. Сегментация CP будет осуществляться с использованием автоматизированного программного обеспечения, разработанного на объекте. Анализ текстуры будет проводиться с использованием последовательности МРТ MP2RAGE. Оценка функции 2/CP будет включать количественные измерения проницаемости капилляров и макрососудистой перфузии. Для изучения проницаемости CP будет использоваться динамическая перфузионная последовательность T1 с усилением гадолинием; t-TRANS и другие региональные значения будут извлечены. Постобработка будет осуществляться с использованием программного обеспечения Syngovia (Siemens). Чтобы изучить макрососудистую перфузию CP, команда будет использовать более короткую версию перфузии с динамической маркировкой артериального спина (без гадолиния), опубликованную ранее 6. Благодаря этой последовательности команда сможет оценить время артериального транзита и видимый кровоток. Анализ данных будет выполнен в CENIR.
• Обнаружение кандидатов в биомаркеры дисфункции CP в спинномозговой жидкости/крови. Для выбора 10 лучших кандидатов в биомаркеры (априори 5 метаболитов и 5 белков), которые будут исследованы с помощью целевого и полностью количественного анализа, будут использоваться два смешанных подхода: i) нецелевая метаболомика и протеомика (результаты будут рассмотрены для оценки возможной связи с функцией CP); и ii) подход, основанный на гипотезах: помимо 5MTHF, на основе данных из литературы и общедоступной биологической базы данных, команда также идентифицировала метаболиты (включая аскорбиновую кислоту и сиаловую кислоту), которые, по-видимому, специфически транспортируются CP, и белки. специфически экспрессируется CP (включая TRPM3 и Klotho). Поскольку концентрации в крови могут влиять на концентрации некоторых молекул в спинномозговой жидкости, команда планирует проанализировать кровь и образцы спинномозговой жидкости одновременно с расчетом соотношения концентраций спинномозговой жидкости/крови.

Для нецелевой метаболомики метаболические экстракты спинномозговой жидкости и образцы плазмы будут получены после осаждения белков с помощью метанола и проанализированы с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (LC-HRMS), как обычно выполняет команда. Платформы HRMS будут использоваться для профилирования как гидрофобных, так и полярных метаболитов8. Предварительная обработка данных и статистический анализ будут осуществляться с помощью Workflow4Metabolomics (W4M), которая представляет собой совместную онлайн-платформу с открытым исходным кодом для вычислительной метаболомики. Аннотация наборов данных и идентификация биологически значимых сигналов будут выполняться с использованием «собственных» спектральных библиотек и экспериментов МС/МС (тандемная масс-спектрометрия). Относительное количественное определение ~250 метаболитов будет достигнуто благодаря нормализации с использованием образцов контроля качества. Для целевого метаболизма 5MTHF СМЖ регулярно измеряется в лаборатории Неккера, специализирующейся на нейрометаболизме, с использованием очень чувствительных и специфичных аналитических методов (жидкостная хроматография, обозначенная через дефис тандемной МС). Команда находится в процессе включения в один и тот же анализ показателей аскорбиновой кислоты и сиаловой кислоты. В зависимости от химической природы кандидатов в метаболитные биомаркеры, выявленных в нецелевом исследовании, будут разработаны один или несколько новых методов надежной количественной оценки с использованием стабильных изотопов.

Предварительное протеомное исследование спинномозговой жидкости пациента с высоким содержанием белка в спинномозговой жидкости и контрольной группы позволит нам установить протокол подготовки проб, выбрать метод масс-спектрометрического анализа и рабочий процесс анализа данных. Цель двоякая: оптимизировать экстракцию белков и позволить сравнить очень разные CSF, чтобы разработать аналитическую стратегию, которая позволит нам идентифицировать биомаркеры. Исследование будет проводиться с использованием подхода без меток, чтобы минимизировать вариабельность, количество шагов и особенно не ограничивать динамический диапазон образца. Все биоинформатические анализы будут выполняться с помощью myProMS9, нашего программного обеспечения для управления и анализа протеомных данных, разработанного в Институте Кюри в сотрудничестве с биоинформатической платформой INSERM U900 под руководством доктора Э. Барийо. Для таргетного протеомного подхода команда будет использовать опыт таргетного МС со стабильными меченными изотопами внутренними стандартными пептидами, золотой стандартный подход для количественного определения белка в биологической жидкости, что приводит к высокой надежности, высокой чувствительности и мультиплексному анализу10.

-Перекрестный анализ данных. Команда будет централизованно управлять, анализировать и интегрировать наборы клинических и биологических данных, а также знания, полученные в результате МРТ и анализа биологических образцов, для выявления глобальной сигнатуры, связанной с ХП, у пациентов с LHIPFOLD. С помощью этих данных команда установит показатель дисфункции ДЦП для использования в повседневной клинической практике, предназначенной для изучения ДЦП у неврологических пациентов.