神経疾患における脈絡叢の機能不全 (PLEXFOLD)

脳葉酸欠乏症（CFD）は、脳脊髄液（CSF）中の低濃度（41nM未満）の5-メチルテトラヒドロ葉酸（5MTHF、葉酸の生物学的に活性な形態）によって定義される状態です1。CFDは「原発性」であると考えられています。葉酸代謝に関与するいくつかの遺伝病に関連しており、重度の運動症状や認知症状を引き起こす場合は、その起源が考えられます。 CFD は「二次的」、つまり遺伝性ミトコンドリア疾患や未確認の疾患などのさまざまな明確な疾患に関連する場合もあります。 二次CFDではCFDが発生する原因が分かりません。 同センターでは、チームは共通の特徴を持つ16人のCFD患者を特定した：深部二次CFD（血中葉酸値は正常であるのに5MTHF<10nM）、高タンパク質CSF>1g/L（N<0.5）、および脳白質の特異的関与。 T2強調MRIでは高信号。 研究チームは、CSF高タンパクおよび葉酸欠乏を伴う白質脳症のこの症候群を「LHIPFOLD」と呼んだ（機密扱い、2022年末に提出予定）。 フランスの代謝生化学研究室ネットワーク内で、チームはさらに 6 人の LHIPFOLDpat (LHIPFOLD 患者) を特定しました。 彼らの平均年齢は 42 ～ 14 歳 (最小 15 歳、最大 77 歳)、性比 1.8 (男性/女性) です。 9/22 には、大きなミトコンドリア DNA 欠失 (Kearns-Sayre) または両対立遺伝子 POLG 変異 (ミトコンドリア DNA 複製欠陥) がありました。 残りの13人の患者は全員、最近まで診断されていなかったが、研究チームは研究状況の中で、ミトリボソームのサブユニットをコードするMRPSファミリーの遺伝子内に、検査を受けた患者4/7の両対立遺伝子変異をin vitroで発見し、検証した。

LHIPFOLD 患者は明らかに脳内 5MTHF 輸送に欠陥がありますが、脳葉酸輸送体の変異はありません。 葉酸はもっぱら脈絡叢（CP）2によって血液から脳に輸送されるため、研究チームはLHIPFOLDにおけるCFDはCP機能不全によるものであると仮説を立てている。 脳室に局在するCPは、血液-CSF関門として機能する血管新生上皮器官で、血液からCSFへ、またはその逆への分子の移動（脳細胞から老廃物を除去する）のための多数のトランスポーターを発現します。 CP はまた、CSF を分泌し、さまざまな機能に関連する CSF 分泌タンパク質を発現します 3。

血液脳関門の変化による高タンパクCSF、および2人のカーンズ・セイヤー患者の脳解剖で異常なCP形態が報告されたことも、LHIPFOLD 4のCP機能不全を裏付けるものである。さらに、チームは2つのLHIPFOLDpatで、非常に高濃度のCSFを発見した。 ＣＳＦシアル酸はシアル酸関連遺伝子の関与を伴わないが、ＣＰはシアル酸排出トランスポーターを強く発現する。 研究チームは最近、他の 2 つの LHIPFOLD パットで自動セグメンテーション後の CP サイズの大幅な減少も測定しました。 これらすべてのデータは、LHIPFOLD における CP 機能不全を強く主張します。

この仮説が正しい場合、CFD を超えて、おそらく全身性 CP 機能不全の結果として他の CSF 異常が存在することを意味します。 葉酸補給は、特に一部の患者において、明らかではあるが限定的な治療効果を示すため、これは治療アプローチの観点から非常に興味深いかもしれない。 残念ながら、私たちの仮説を評価するために、CP 機能を評価するための利用可能な臨床的調査はありません。一方、CP の機能不全/変化は、いくつかの一般的な神経疾患の潜在的な病因として示唆されています (以下の文章では、チームは機能不全と変化の両方を表す機能不全を使用します) ）。 ディープ CFD が示唆するように、LHIPFOLD では CP 機能不全が特に重篤であると研究チームは考えているため、チームは LHIPFOLD 症候群が CP 機能を評価する関連診断ツールの能力を検証するための非常に有用な臨床モデルであると考えています。 したがって、プロジェクトの目的は次のとおりです。

1. CP を中心としたイメージング、メタボロミクス、プロテオミクスのアプローチを使用して、CP に関連する特定の MRI および生化学的シグネチャを特定することにより、LHIPFOLD における CP 機能不全を証明します。
2. 治療に直接適した LHIPFOLD 内の CP 関連生化学バイオマーカーを特定します。
3. 臨床現場で CP 機能を評価するための画像検査および生化学的診断検査をセットアップします (バイオマーカーに基づく CP 機能不全スコア)。

方法論 目的を達成するために、チームは、LHIPFOLDpat と健康なボランティア (HV) の CP 探索のために特別に設計された補完的な診断ツールによってサポートされた、記述的で決定論的な統計および多次元クラスタリングのアプローチに基づいて、単中心診断の第 1 相症例対照研究を実施します。神経学的コントロール患者（NCpat）。 NCpat は、LHIPFOLDpat で特定された CP 関連のシグネチャの特異性を評価するために使用されます。 研究チームは、一部の NCpat では所見が HV と同様になるが、他の患者では軽度から中等度の CP 機能不全を反映すると予想しています。 AP-HPを研究スポンサーとして、チームは現行の法律および規制要件に従って、「Jardé 1」研究について研究倫理委員会の承認を得る予定です。

-患者および対照の選択および採用 被験者は、2 年間にわたって前向きに採用されます。1) LHIPFOLDpat は前述のように選択されます。 2)HVは通常の広告手順で募集され、LHIPFOLDpatと年齢と性別がマッチングされます。 3) NCpat は、神経内科で頻繁に検査される特定の一般的な脳疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、特発性頭蓋内圧亢進症、正常圧水頭症を患う、年齢と性別が一致した患者となります。 これらの疾患の診断は、各疾患を専門とする神経内科医が最新のガイドラインに基づいて行います。 採用されるサンプルに関して、チームは 2 つの制約を考慮しました。1 つは LHIPFOLDpat の数が限られているということです。この研究は、対照群との単純な決定論的な比較ではなく、同種の患者クラスターを通じて CP 関連の兆候の特定につながる多次元分析です。 したがって、戦略は、5 つまたは 6 つのバイオマーカーに基づいて患者を均一に分類できるグローバルなサンプル サイズを特定することでした。 Donicar の公式 5 によれば、層別サンプリング技術によって適切に選択された 2^6 の患者はこれを可能にするはずです。 これらの 64 人の患者には、15 人の LHIPFOLDpat と、同数の 25 人の HV と 25 人の NCpat が含まれます。 さらに、決定論的アプローチを維持し、それぞれ 15 名と 25 名の被験者を対象とした LHIPFOLDpat および NCpat における CSF 5MTHF の平均値と標準偏差 (それぞれ 3.85 +/- 2.67 および 49.53 +/- 13.35) を統合したシミュレーション研究に基づいて、このサンプルサイズは以下を提供します。これら 2 つのグループ間の Wilcoxon Rank Sum 検定による差異を示す検出力は 95% を超えます (HV の値は現在不明であることに注意してください)。

チームは、すべての被験者から脳のMRIデータ（血液ガドリニウム注射による）、血液およびCSFサンプルを収集します。 LHIPFOLDpat と NCpat は、ピティエ・サルペトリエール病院の神経内科の標準治療の一環としてこれらの処置を受けることになります。 HV はある日、私たちの臨床調査センターに入院する予定です。 すべての被験者はインフォームドコンセントに署名し、HV の研究目的で MRI 検査と血液および CSF サンプリングを受けること、および患者の追加の MRI 時間取得とサンプル量に同意します。

• 脳 MRI 研究 脳 MRI は、パリ脳研究所 (ICM) の画像プラットフォームである神経画像研究センター (CENIR) の 3 TESLA (Siemens PRISMA) で実施されます。 チームは CP の形態と機能の両方を評価します。 1/CP 形態分析の場合、チームは CP の体積を測定し、テクスチャ パラメーターを抽出します。 CP セグメンテーションは、現場で開発された自動ソフトウェアを使用して実行されます。 テクスチャ解析は MP2RAGE MRI シーケンスを使用して実行されます。 2/CP 機能評価には、毛細血管透過性と大血管灌流の定量的測定が含まれます。 CP 透過性を調べるために、ガドリニウム増強を伴う動的 T1 灌流シーケンスが使用されます。 t-TRANS およびその他の地域値が抽出されます。 後処理は、Syngovia (Siemens) ソフトウェアを使用して実行されます。 CP 大血管灌流を調査するために、チームは以前に公開された動的動脈スピン ラベリング灌流 (ガドリニウムなし) の短いバージョンを使用します 6。 このシーケンスにより、チームは動脈通過時間と見かけの血流を評価できるようになります。 データ分析はCENIRで行われます。
• CSF/血液コンパートメントにおける CP 機能不全バイオマーカー候補の発見 2 つの混合アプローチを使用して、標的を絞った完全定量分析によって調査される上位 10 のバイオマーカー候補 (先験的に 5 つの代謝産物と 5 つのタンパク質) を選択します。i) 非標的メタボロミクスおよびプロテオミクス (結果は CP 機能との関連性を評価するために検討されます); ii) 仮説に基づくアプローチ: 5MTHF に加えて、文献および公的に入手可能な生物学的データベースからのデータに基づいて、研究チームは CP によって特異的に輸送されると思われる代謝産物 (アスコルビン酸およびシアル酸を含む) およびタンパク質も特定しました。 CP (TRPM3 および Klotho を含む) によって特異的に発現されます。 血液濃度は一部の分子のCSF濃度に影響を与える可能性があるため、研究チームは同時に採取した血液とCSFを分析し、濃度のCSF/血液比を計算することを計画している。

非標的メタボロミクスの場合、CSF および血漿サンプルの代謝抽出物はメタノールによるタンパク質沈殿後に取得され、チームが日常的に行っている高分解能質量分析計 (LC-HRMS) と組み合わせた液体クロマトグラフィーによって分析されます。 HRMS プラットフォームは、疎水性代謝産物と極性代謝産物の両方をプロファイリングするために使用されます8。 データの前処理と統計分析は、計算メタボロミクスのためのオープンソースの共同オンライン プラットフォームである Workflow4Metabolomics (W4M) を使用して実現されます。 データセットの注釈と生物学的に関連するシグナルの識別は、「社内」スペクトル ライブラリと MS/MS (タンデム質量分析) 実験を使用して実行されます。 品質管理サンプルを使用した正規化により、約 250 の代謝物の相対定量が達成されます。 標的メタボロミクスの場合、CSF 5MTHF は、神経代謝を専門とするネッカー研究室で、非常に高感度かつ特異的な分析方法 (タンデム MS に連結された液体クロマトグラフィー) を使用して日常的に測定されます。 研究チームは、アスコルビン酸とシアル酸の対策を同じ実行に含める作業を進めている。 非標的研究で特定された代謝産物バイオマーカー候補の化学的性質に応じて、安定同位体を使用した確実な定量のための 1 つまたはいくつかの新しい方法が開発されます。

CSFタンパク質が高い患者と対照のCSFに関する予備的なプロテオミクス研究により、サンプル調製プロトコルを確立し、質量分析分析方法とデータ分析ワークフローを選択することができます。 目的は 2 つあります。タンパク質の抽出を最適化することと、バイオマーカーを特定できる分析戦略を開発するために、非常に異なる CSF の比較を可能にすることです。 研究は、ばらつきやステップ数を最小限に抑え、特にサンプルのダイナミックレンジを制限しないように、ラベルフリーのアプローチを使用して実行されます。 すべてのバイオインフォマティクス分析は、E. Barillot 博士が指揮する INSERM U900 バイオインフォマティクス プラットフォームと協力してキュリー研究所で開発されたプロテオミクス データ管理および分析ソフトウェアである myProMS9 を使用して実行されます。 標的プロテオミクスアプローチについて、チームは、安定同位体標識内部標準ペプチドを用いた標的 MS に関する専門知識を利用します。これは、体液中のタンパク質定量化のゴールドスタンダードアプローチであり、その結果、高い堅牢性、高感度、多重分析が実現します 10。

-クロスデータ分析チームは、LHIPFOLD患者における全体的なCP関連の特徴を特定するために、MRIおよび生物学的サンプル分析によって生成された臨床および生物学的データセットと知識を一元的に管理、分析、統合します。 これらのデータを使用して、チームは日常的な臨床診療で使用するための CP 機能不全スコアを確立し、神経疾患患者の CP を調査するために使用することを目的としています。