潜伏结核分枝杆菌感染的新型微生物诊断测试的评价 (MICRO-LTBI)

目标：

i) 确定是否可以在从以下来源分离的 CD34+ 外周血单核细胞 (PBMC) 中检测到结核分枝杆菌 (Mtb) DNA

• 接受 LTBI 筛查的无症状成年人（LTBI 筛查者）
• 新诊断的活动性结核病成人（活动性病例） ii) 确定从最近家庭结核病接触者的 CD34+ PBMC 中分离出的结核分枝杆菌菌株是否与从他们接触过的肺结核指示病例的痰液中分离出的菌株在基因上相同 iii ) 表征在 IGRA 阳性和阴性异质群体中检测 CD34+ PBMC 中 Mtb 的能力的免疫学、临床和流行病学相关性LTBI 筛选。

iv) 确定 IGRA 阳性 LTBI 筛选者的 CD34+ PBMC 中 Mtb DNA 的存在是否与最近报道的外周血转录特征的存在相关，以预测进展为活动性结核病的风险 v) 评估 CD34+ PCR 检测结果的纵向变化

- LTBI 筛选者完成 LTBI 化学预防

• 未接受化学预防的 LTBI 筛查者
• 完成活动性结核病治疗的患者

4.1.背景

结核病 (TB) 是一种由结核分枝杆菌复合体 (MTBC) 微生物引起的传染病。 人类的主要病原体是结核分枝杆菌（Mtb）。 结核病通常影响肺部，并通过吸入活动性肺结核患者咳出的传染性飞沫传播。 纵观人类历史，结核病一直是发病和死亡的主要原因。 在欧洲和北美，结核病病例在 17 世纪和 18 世纪激增，随后迅速下降，这主要归因于社会经济条件的改善、公共卫生措施的应用以及结核病患者的隔离。 1 到了 19 世纪末，在欧洲和北美结核病病例和死亡人数呈下降趋势之后，结核分枝杆菌的发现和X射线这两个重大事件成为结核病诊断和治疗的关键。1随后，牛分枝杆菌疫苗接种20 世纪上半叶卡介苗 (BCG) 和抗生素治疗让全球乐观地认为结核病的控制和消除是可以实现的。 然而，结核病至今仍然是一个严重的公共卫生威胁，并且是全球第二大传染病死亡原因。 2, 3 根据 2015 年世界卫生组织报告，2014 年全球估计新增 960 万结核病病例（其中 12% 为艾滋病毒合并感染者）和 150 万人死亡（其中 40 万人为艾滋病毒合并感染者）。4 此外，估计全球三分之一的人口患有潜伏性结核菌感染 (LTBI)，其中约 10% 的人一生中会患上活动性结核病。 5

尽管只有22个低收入或中等收入国家(LMIC)占全球负担的80%，但结核病仍然是高收入国家移民人群中的一种重要疾病。 在英国，20 世纪实现的结核病发病率下降趋势出现逆转，1998 年至 2009 年间结核病通报数量增加了 50%。6 2013 年，总共报告了 7,892 例结核病病例，相当于每年每 10 万人口 12.3 例，是高收入国家中最高的。7 英国的结核病病例中，伦敦占很大比例（37.8%），那里的结核病发病率为每年每10万人35.5例；来自印度（30%）、巴基斯坦（20%）和索马里（5%）的移民占这些病例的大多数。 7

目前，结核病控制的关键策略是准确、快速地诊断活动性疾病并采取有效治疗来阻断传播。 然而，延迟诊断是促进社区传播的主要挑战。8 一般来说，结核病患者从出现症状到开始治疗需要几个月的时间。 例如，在英国，近三分之一的肺结核患者在出现症状 4 个月后开始治疗。7 如此长时间的延误，加上大量 LTBI 患者，表明需要采取干预措施来识别和治疗 LTBI 患者，以实现结核病控制。 LTBI 的抗菌治疗（化学预防）可有效降低再激活的风险，并且在高收入、低发病率环境中常规实施。 然而，这项政策的实施，特别是在高负担环境中，由于缺乏诊断测试来识别有发展为活动性结核病风险的结核分枝杆菌敏感个体的子集，因此受到阻碍，而化学预防应针对这些人。

目前，LTBI 的诊断是通过检测对 Mtb 感染的适应性免疫反应来进行的，无论是体内（使用结核菌素皮试）还是离体（使用干扰素-γ 释放测定 [IGRA]）。 这种方法不能直接检测 Mtb，其局限性在于它无法区分有再激活风险的 10% 的致敏个体（化学预防可能对其有益）和 90% 的免疫致敏但不致敏的个体。进展为活动性疾病（化学预防对其没有益处）。 后一组人可能具有异质性：一些人可能已经消除了感染，而另一些人可能患有 LTBI，但能够无限期地遏制它。 9 剖析这些可能的表型的工具可以实现更精确的化学预防目标，但目前还缺乏这些工具。 在这项研究中，研究人员将调查从 a) 接受 LTBI 筛查的成人（LTBI 筛查者）和 b) 新诊断的活动性结核病成人（活动病例）的外周血中分离出的 CD34+ 细胞中是否可以检测到 Mtb。

4.2.研究理由

这项研究建立在柏林马克斯·普朗克感染生物学研究所的一位联合研究人员 (Stephen Reece) 最近的一项观察基础上，该研究人员在 CD34+ 长期再生多能造血干细胞中检测到了 Mtb DNA (LTpHSC) 从 7 名患有 LTBI 的健康成年人（IGRA 阳性，排除活动性结核病）的 100 ml 外周血中分离出来；在 7 名 IGRA 阴性健康成人的 LTpHSC 中未检测到 Mtb DNA。 10 如果这一非凡的发现可以在其他环境中复制，则可能会导致新型微生物测试（“CD34+ PCR 检测”）的开发，并具有多种潜在应用：

a) 识别潜在感染抗生素耐药结核分枝杆菌的个体（以便选择适当的化学预防方案）， b) 监测化学预防和旨在预防 LTBI 感染的干预措施的效果，例如疫苗和微量营养素补充计划， c ) 追踪特定菌株在人群中的传播（为公共卫生干预提供工具）， d) 区分有进展为结核病风险的 Mtb 敏感个体e) 为 LTBI 的免疫生物学和人类结核病的发病机制提供新的见解。

4.3.假设

i) 在诊断时无症状 IGRA 阳性成人和活动性结核病例的 CD34+ PBMC 中可以检测到 Mtb DNA，但在 IGRA 阴性成人中则不能检测到。

ii) 从无症状 IGRA 阳性结核病接触者的 CD34+ PBMC 中分离出的 Mtb 菌株与从他们最近接触过的肺结核指标病例的痰中分离出的菌株在基因上是相同的。

iii) 在 LTBI 筛查者的 CD34+ PBMC 中检测 Mtb DNA 的能力与 IGRA 结果以及公认的 LTBI 临床和流行病学危险因素相关 iv) 在 IGRA 阳性 LTBI 筛查者的 CD34+ PBMC 中检测 Mtb DNA 的能力与外周血转录组特征相关先前定义为与活动性结核病进展相关 v) 抗菌治疗可有效消除 CD34+ 中的结核分枝杆菌从 LTBI 或活动性结核病患者中分离出的 PBMC，在基线时可检测到 PBMC；并且 CD34+ PCR 检测的结果在未接受化学预防的 LTBI 筛查者中重复时是可重复的

5. 目标

5.1.主要目标

确定是否可以在从以下来源分离的 CD34+ 外周血单核细胞 (PBMC) 中检测到结核分枝杆菌 (Mtb) DNA

• 接受 LTBI 常规筛查的无症状成年人（LTBI 筛查者）
• 新诊断的活动性结核病成人（活动性病例）

5.2.次要目标

• 确定从结核病接触者的 CD34+ PBMC 中分离出的结核分枝杆菌菌株是否与从他们接触过的肺结核指示病例的痰中分离出的菌株在基因上相同
• 旨在描述在 IGRA 阳性和阴性 LTBI 筛选者的异质群体中检测 CD34+ PBMC 中 Mtb 的能力的免疫学、临床和流行病学相关性。
• 确定 IGRA 阳性筛选者的 CD34+ PBMC 中 Mtb DNA 的存在是否与最近报道的外周血转录特征的存在相关，可预测进展为活动性 TB11 的风险
• 评估 CD34+ PCR 检测结果的纵向变化
• LTBI 筛查者完成 LTBI 化学预防
• 未接受化学预防的 LTBI 筛查者
• 完成活动性结核病治疗的患者

研究设计和研究访问

研究人员将进行一项纵向研究。 将招募两组参与者：接受 LTBI 筛查的成年人（LTBI 筛查者）和即将开始活动性结核病治疗的患者（活动性病例）。 LTBI 筛查对象是指作为标准护理的一部分而接受 LTBI 筛查的人员：他们包括传染性结核病例的近期接触者、来自结核病高负担国家的新进入者、接受职业健康筛查的卫生工作者以及即将接受免疫抑制治疗的患者。 活动性结核病患者是指已被诊断为活动性结核病并即将开始接受抗结核治疗的患者。

在基线（访问 1）时，满足纳入标准并书面知情同意参与研究的参与者将被要求提供社会人口统计信息，包括年龄、性别和种族起源的详细信息以及结核病暴露史的详细信息（包括具体暴露史）参加研究的活动性结核病参与者）和其他临床相关数据，所有这些都将记录在病例报告表（CRF）上。 如果常规护理中尚未进行艾滋病毒血清学检测，则将进行该检测。 将收集 120 毫升（如果常规护理中已进行 HIV 检测则为 117 毫升）血样用于 IGRA (QFT-Plus)、结核分枝杆菌血培养、外周血转录组风险特征分析以及结核分枝杆菌 DNA 的 CD34+ PCR 检测在基线。 通过临床评估和胸部 X 光检查（标准护理的一部分）排除活动性结核病的 IGRA 阳性参与者，如果符合该治疗的标准（也是标准护理的一部分），将接受为期 3 个月的利福平和异烟肼化学预防疗程。护理）.12

HIV 检测阳性结果的通报将根据 2008 年英国国家 HIV 检测指南的建议进行处理。 HIV 检测呈阳性的结果将在 Barts Health NHS Trust 生殖泌尿医学 (GUM) 诊所（当地 HIV 服务）的护士在场的情况下与研究医生进行面对面访谈。 HIV 检测呈阳性的参与者将被转介到最近的 GUM 诊所，以确认其结果并酌情进行进一步管理。

3 个月（访视 2）时，将记录化学预防处方和遵守化学预防的详细信息，并采集第二份血样（117 毫升）用于重复 IGRA (QFT-Plus)、血培养和 CD34+ PCR 测定。 对于采取化学预防措施的参与者，还将在第 2 次访视时采集 Tempus 管。

在基线（访问 1）时，符合纳入标准并书面知情同意参与研究的参与者将被要求提供基本的社会人口统计信息，包括年龄、性别和种族起源以及症状持续时间、与任何人的接触情况等详细信息。登记的 LTBI 筛选者和其他临床相关数据，所有这些都将记录在 CRF 上。 HIV 血清学检查、全血细胞计数、痰涂片镜检和结核分枝杆菌培养是该患者组常规护理的一部分。 将收集 114 ml 血样用于 IGRA (QFT-Plus)、Mtb 血培养以及基线 Mtb DNA 的 CD34+ PCR 检测。 根据英国指南，结核病患者将接受活动性疾病治疗。 12

化疗完成后（第 2 次就诊，通常在 6 个月时），将记录抗结核治疗处方和依从性的详细信息，并收集第二份血样（114 毫升）用于 IGRA (QFT-Plus)、血培养用于 Mtb 和 CD34+ PCR 检测。

学习程序

邀请和知情同意程序

邀请函

在伦敦，使用 IGRA 筛查 LTBI 通常在四组中进行：最近接触过的活动性结核病患者；来自结核病高负担国家的新进入者；即将开始免疫抑制治疗的患者；以及接受职业健康检查的卫生工作者。 最初可能会在各种不同的环境（结核病诊所、初级保健、风湿病诊所、职业健康服务）中识别出有 LTBI 风险的群体，但他们都会被转诊至结核病诊所（接触者、新进入者、即将开始免疫抑制治疗的患者） ) 或到职业健康诊所（接受职业健康筛查的卫生工作者）进行 LTBI 筛查。 因此，将在结核病诊所或职业健康诊所确定并招募潜在合格的 LTBI 筛查者参加研究。 Barts Health NHS Trust 结核病诊所将识别并招募活动性结核病患者。

在结核病诊所或职业健康诊所工作的护士或医生将向潜在符合条件的个人通报该研究，他们将结核病筛查作为常规临床护理的一部分。 临床护理团队成员将向那些表示对研究感兴趣的人提供参与者信息表。 这将解释研究的目的、方法、预期收益和潜在危险，并将在必要时以英语或其他语言的非技术语言进行呈现。 那些填写参与者信息表的人将被要求填写一份“联系单”，提供他们的联系方式，并授权研究团队在他们有机会阅读信息后与他们联系；该“联系单”将由参与者的日常护理团队转发给研究团队。

知情同意程序

知情同意将根据 JRMO 标准操作程序进行。 知情同意书将由接受过良好临床实践专门培训并签署知情同意书的人员在私人房间内签署，这些人员可能是医生、护士或研究助理。 在同意过程中，参与者将被告知参与是自愿的，他们可以在随访期间以任何理由拒绝参加研究或退出。

参与者将被要求通过签名并打印自己的名字来表明他们同意参与。 对于在同意过程中需要口译员的人，将需要公正的证人会签同意书。 参与者将获得与每次访问相关的旅行费用的经济补偿。

报名及后续程序

基线招募

将根据上述纳入和排除标准评估潜在参与者的资格。 遵循同意程序并在参与者书面知情同意参与后，将分配一个唯一的 ID 号。 参与资格的评估将由经过适当培训的人员（可能是医生、护士或研究助理）进行。

数据收集程序

使用 CRF，在访问 1 (V1) 时，所有参与者将被要求提供社会人口统计信息和病史，包括用药史。 LTBI 筛选者将被要求提供最近和以前接触过结核病患者的详细信息、结核病史和 LTBI 的其他潜在决定因素，例如与活动性结核病患者的物理距离、平均每日接触时间以及接触指示病例的总时间。 CRF 还将包括以下数据：资格标准清单、基线临床检查和实验室测试结果以及随访期间收集的信息，包括退出详细信息（如果适用）。 负责完成 CRF 的项目团队成员（可能是研究员或现场工作人员）将列在授权日志中。

基线样本采集和实验室评估

将按照图 1 以及表 1 和 2 中的详细说明收集样品，并按照表 3 和 4 中的详细说明进行实验室分析。 作为日常护理的一部分进行测试（例如 活动性结核病患者的全血细胞计数、活动性结核病患者的 HIV 血清学检查和 IGRA 阳性 LTBI 筛查者），结果将通过 CRS 获取并记录在 CRF 上。 IGRA 阴性 LTBI 筛查者和未暴露的参与者将在第 1 次访视时接受 HIV 检测。

为了调查从结核病接触者的 CD34+ PBMC 中分离出的 Mtb 菌株是否与从其接触过的指标病例痰液中分离出的菌株相匹配，将从参与本研究的 CD34+ PCR 检测呈阳性接触者的 10 名指标活动性结核病患者中采集痰液样本，将对从这些样本中培养的分离株进行全基因组测序分析。 基于此分析，将使用生物信息学方法设计创建 Mtb 扩增子文库的引物，以捕获菌株多样性。 然后，这些引物将用于从含有从结核接触者中分离出的 Mtb 基因组 DNA 的 CD34+ 细胞中生成 Mtb 扩增子文库。 然后将对这些文库进行测序，并与指示病例的结核分枝杆菌基因组进行比较，以确定从指示病例和接触者中分离出的菌株是否匹配。

HIV 检测/IGRA 呈阳性的参与者将分别转介至 HIV/结核病诊所进行进一步评估。 出于研究目的而进行 HIV 检测和 IGRA 的地方（即 当这些结果不属于常规护理的一部分时），研究人员将在有机会时将这些结果传达给参与者。

后续程序

• LTBI 筛选者：访问和后续评估详见图 1、表 1 和表 3。参与者将在 3 个月时参加访问 2（访问 2，V2）。 完成化学预防的参与者将在治疗完成后进行常规临床评估。 那些不采取化学预防措施的患者也将在 V1 后 3 个月进行随访。 除了完成详细说明活动性结核病症状（所有参与者）和坚持化学预防（接受化学预防的人）的 CRF 外，还将收集 117 毫升血样进行免疫学和分子分析，详见下文第 13.3 节。 第二次访问完成后，研究参与即告结束。
• 活动性结核病患者：访视和随访详见图 1、表 2 和表 4。接受抗结核治疗的参与者将在治疗完成后进行常规临床评估，并在治疗期间采集第二份 114 毫升血样。这次访问是为了进行免疫学和分子分析，详情请参见下文第 13.3 节。 完成第二次访问后，研究参与即告结束。

CD34+ PCR 检测的结果不会用于指导临床管理，因为该检测是处于开发早期阶段的研究工具，其结果尚未与任何临床结果相关。

参与者退出

如果参与者撤回其参与同意或认为退出符合参与者的最佳利益，则参与者将退出。 如果参与者尽管有书面和电话提醒但未能参加第二次预定的研究访问，也将被视为退出。 如果参与者退出研究，退出原因将记录在 CRF 中。

除非参与者另有要求，否则截至退出时收集的数据将包含在研究分析中。 参与者退出之前采集的任何临床样本将用于研究分析。

研究结束定义

当所有参加随访的参与者的所有临床和实验室评估完成后，研究将结束。

9. 统计考虑因素

9.1 样本量

本研究的主要目的是验证和扩展另一个环境中的发现，在该环境中，在从 7 名 IGRA 阳性无症状成人的外周血中分离出的 CD34+ 细胞中检测到 Mtb 基因组 DNA。 10 为了实现这一目标，将总共招募 100 名 LTBI 筛查者参加横断面研究（每个自变量 20 名参与者在回归分析中进行测试）。 预计其中大约 50 名参与者将呈 IGRA 阳性，其中大约 40 名将接受化学预防治疗：对其中 25 名参与者的随访将在 5% 显着性水平上给出 >80% 的功效，以证明CD34+ PCR 阳性个体的比例从基线时的 80% 降至随访时的 30%。

10. 道德考虑

在研究开始之前，将寻求 NHS REC 批准研究方案、知情同意书和其他相关文件。 在获得伦理委员会必要的批准并且申办者为激活站点“开绿灯”之前，研究不会开始。 CI 将确保本研究按照《赫尔辛基宣言》（2013 年）以及《健康和社会关怀研究治理框架》（2005 年第二版）及其后续修正案中的伦理原则进行。 关于修正案是否构成次要修正案或重大修正案的决定将由发起人决定。 需要 REC 审查的实质性修正案只有在获得相关机构批准后才会实施。 与申办者和 REC 的所有通信都将保留在研究主文件中。 CI 将在研究结束时通知 REC 和申办者。

在参与本研究之前，经过适当培训的人员（可能是医生、护士或研究助理）将获得参与者的书面知情同意书。 必要时将提供英语和其他语言的信息表。 我们将向潜在参与者提供信息表，并解释研究的目的、方法、预期益处和潜在危险。 在同意过程中，将向参与者解释参与是自愿的，他们可以在随访期间以任何理由拒绝参加研究或退出。

利益冲突

尚未发现 CI 或任何联合研究者有任何财务或其他竞争利益。

11. 安全注意事项

由于该研究是观察性的，因此与研究相关的不良事件的风险可以忽略不计。 然而，任何被认为与研究相关的不良事件将在 24 小时内报告给申办者。 一些参与者可能认为要采集的血液量（最多 120 毫升）很大，但献血的成年人通常一次献血 500 毫升而不会出现贫血。 因此，研究人员预计不会出现与抽取如此体积的血液相关的任何不良事件。 有关血样量以及这是否会产生任何不良健康后果的信息将在信息表中向参与者解释。 作为常规临床护理的一部分，所有结核病患者都将接受贫血筛查，入院时血红蛋白水平低于 10 g/dl 的患者将被排除在外。 此外，将采取以下措施来尽量减少参与者在本研究过程中可能遇到的潜在不便、不适和风险：

- 使用经过适当培训的工作人员进行放血

12. 数据处理和记录保存

12.1。保密性

将为研究筛选的所有参与者收集进行研究和分析所需的受保护健康信息 (PHI)；该信息将包括每位参与者的姓名、出生日期、性别、地址、电话号码、病历号码（如果适用）、电子邮件地址（如果适用）以及种族血统。 需要访问 PHI 以便进行或分析研究的研究人员将列在授权日志中。 PHI 将予以保密，并将根据 1998 年数据保护法进行处理、处理、存储和销毁。 参与者将保留在研究期间随时撤销使用其 PHI 的授权的权利。 在本研究的出版物中，所有参与者都将匿名。 数据将按如下方式进行伪匿名化。 PHI 将保存在与唯一识别码链接的安全数据库中。 临床信息将保存在一个单独的安全数据库中，并链接到相同的唯一识别码。 CI 和联合研究人员将可以访问伪匿名的最终研究数据集。

在研究过程中，所有记录将由 CI 负责并妥善保存。 研究完成后，申办者要求记录和数据再保存 20 年。 CI 将充当研究数据的“保管人”。 获取 PHI 的人数将仅限于进行研究、质量控制、审计和分析所需的最低人数。 以下内容将包括源文件：筛查日志、知情同意书和纸质 CRF。 所有源文件将安全地存放在上锁的文件柜中。 数据传输和传输将根据 1998 年英国数据保护法进行。 个人身份信息不会被存储、传输或发送到任何便携式设备或从任何便携式设备发送，除非该设备经过加密。

12.2. 数据收集、记录和处理

签署的同意书和包含源数据的纸质文件将被安全存储。 研究数据将被输入 EpiData Entry 软件的数据库中。 工作人员将接受适当的培训以使用数据库进行数据输入。 实验室数据将输入数据库。

CI 和联合研究者将可以在研究期间访问研究数据。 需要此类访问权限以进行研究的研究人员也将获得必要的此类访问权限。 必要时，申办者、主办机构和监管机构的授权代表也将有权访问研究期间的研究数据。

12.3。 质量控制和质量保证

研究文件将根据要求提供给申办者和 REC 的代表，以进行质量控制和质量保证。

13. 实验室

13.1. 样品采集、标记和处理

研究人员将采集血样，贴上参与者 ID 标签并注明日期。 根据制造商的建议，收集后立即剧烈摇动 Tempus 管。 血培养和艾滋病毒血清学样本将被运送到中央实验室进行处理。 剩余的血液样本将被运送到暴雪研究所，在那里记录样本接收日期和时间以及样本状况（例如， 非凝结）将被记录在实验室日志中。 用于 QFT-Plus 测试的样品将在收到样品后立即在 37°C 下孵育 18 小时，然后离心并吸出上清液，将上清液储存在 -80C 下以待分析 IFN-γ 浓度。 Tempus 管中的血液样本将储存在 -80 °C 的标记架中，等待运输至伦敦大学学院感染与免疫部门进行 RNA 提取和基因表达谱分析。 PBMC 将从剩余样品 (100 ml) 中分离出来，随后使用磁珠分选分离 CD34+ 细胞。 分离的 CD34+ 细胞的纯度将通过流式细胞术检查。