HPV imunologické markery perzistující cervikální infekce a onkogeneze (HPVImmuno)

Cílem této studie je analyzovat hostitelské faktory, včetně virově specifické imunity a parametrů souvisejících s HPV, které ovlivňují nástup a progresi skvamózní intraepiteliální léze (SIL), s cílem definovat stratifikaci rizika a přizpůsobit léčbu, vyvinout široce dostupné a ne - imunoskóre invazivních testů s vysokou prediktivní hodnotou.

Bude také hodnocena progrese skvamózní intraepiteliální léze (H SIL) po 2 letech u žen s abnormálním pap stěrem (primární cílový bod) a imunitní profil hostitele po anti-HPV profylaktické a terapeutické vakcinaci, u žen s dlaždicovými intraepiteliálními lézemi a s bude analyzována perzistence infekce (sekundární koncový bod).

Budeme analyzovat pacienty zařazené prospektivně s abnormálním pap stěrem každých šest měsíců až dva roky po diagnóze. V každém časovém bodě, během kolposkopie, budou odebrány vzorky periferní krve (30 ml) a cervikální vzorky (vaginální výplach, cervikální biopsie a pap-stěr) pro charakterizaci lokální a periferní imunitní odpovědi. Virová zátěž, HPV integrace budou hodnoceny na cytologických a tkáňových vzorcích získaných od pacientů v době diagnózy a/nebo kurativního chirurgického zákroku.

Pro sekundární cílové parametry zařadíme pacienty s potvrzenou infekcí HPV, kteří podstupují terapeutickou a profylaktickou vakcinaci proti HPV. Očkování bude provedeno ihned po diagnóze HPV léze. Následný program zahrnuje kolposkopii každých šest měsíců po dobu 2 let. Budeme analyzovat HPV specifickou imunitní odpověď každých šest měsíců a virovou nálož a ​​HPV integraci v době diagnózy a na konci sledování.

K vyhodnocení antigen-specifické proliferativní odpovědi budou PBMC stimulovány v triplikátech v 96-jamkových destičkách s kulatým dnem s antigeny L1, E6, E7 proteiny HPV-16 a -18 a lidskými aktinovými peptidovými pooly po dobu 7 dnů. Kultivační médium bylo RPMI 1640 doplněné 2 mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml roztoku streptomycinu, 10 % teplem inaktivovaného FBS, 1 mM pyruvátu sodného, ​​100 uM neesenciálních aminokyselin 0 uM a 5 - merkaptoethanol. Po kultivaci budou buňky promyty, obarveny živým/mrtvým fixovatelným fialovým barvivem) a následně CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Nakonec se buňky promyjí a resuspendují v PBS 1% paraformaldehydu.

Index buněčné proliferace (CPI) pro antigen-specifické expandované T-buňky bude stanoven odečtením procenta CD25+ICOS+ CD3+CD4+ nebo CD3+CD8+ detekovaných v PBMC inkubovaných s aktinovými peptidy od procenta CD25+ICOS+ T-buněk. podskupiny detekované v PBMC inkubovaných s HPV peptidy. CPI <1,5 % bude považováno za negativní, zatímco hodnota ≥1,5 % bude považována za pozitivní.

Analýzy průtokovou cytometrií byly provedeny pomocí průtokového cytometru FACS Canto II a softwaru BD DIVA.

Pro analýzu vlastností souvisejících s HPV budou použity molekulární přístupy. HPV DNA bude extrahována z biopsií a výtěrů z lézí pomocí automatizovaných systémů po specifickém ošetření tkání lýzou.

HPV DNA bude poté kvantifikována pomocí PCR v reálném čase specifické pro oblasti L1/E2 a E6; podrobně bude použit MY 09/11 fragment genu L1. Výsledky budou vyjádřeny jako počet kopií/100 000 buněk a normalizovány pomocí housekeeping genu.

Pro diferenciální kvantifikaci integrované nebo epizomální HPV DNA bude použit specifický standardizovaný systém pro amplifikaci ORF E2 a E6.