Marcadores imunológicos de HPV de infecção cervical persistente e oncogênese (HPVImmuno)

O ponto final deste estudo é analisar os fatores do hospedeiro, incluindo a imunidade específica do vírus e os parâmetros relacionados ao HPV que influenciam o início e a progressão da lesão intraepitelial escamosa (SIL), a fim de definir a estratificação de risco e adequar o tratamento, desenvolvendo amplamente acessível e não -ensaios invasivos imunoescore com alto valor preditivo.

A progressão da lesão intraepitelial escamosa (H SIL) aos 2 anos em mulheres com exame de Papanicolaou anormal também será avaliada (desfecho primário) e o perfil imunológico do hospedeiro após vacinação profilática e terapêutica anti-HPV, em mulheres com lesões intraepiteliais escamosas e com a persistência da infecção será analisada (desfecho secundário).

Analisaremos os pacientes inscritos prospectivamente com exame de Papanicolaou anormal a cada seis meses até dois anos após o diagnóstico. A cada momento, durante a colposcopia, serão coletadas amostras de sangue periférico (30 mL) e cervicais (lavado vaginal, biópsia cervical e papanicolau) para caracterização da resposta imune local e periférica. A carga viral e a integração do HPV serão avaliadas em amostras citológicas e de tecido obtidas dos pacientes no momento do diagnóstico e/ou cirurgia curativa.

Para os desfechos secundários, inscreveremos pacientes com infecção confirmada por HPV, submetidos à vacinação terapêutica e profilática contra HPV. A vacinação será realizada imediatamente após o diagnóstico da lesão pelo HPV. O programa de acompanhamento implica colposcopia a cada seis meses durante 2 anos. Analisaremos a resposta imune específica do HPV a cada seis meses, e a carga viral e a integração do HPV no momento do diagnóstico e no final do acompanhamento.

Para avaliar a resposta proliferativa específica do antígeno, as PBMCs serão estimuladas em triplicata em placas de fundo redondo de 96 poços com antígenos L1, E6, proteínas E7 de HPV-16 e -18 e pools de peptídeos de actina humana por 7 dias. O meio de cultura foi RPMI 1640 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de solução de estreptomicina, 10% de FBS inativado por calor, 1 mM de Piruvato de Sódio, 100 µM de aminoácidos não essenciais e 50 µM de 2 -Mercaptoetanol. Após o cultivo, as células serão lavadas, coradas com Live/Dead Fixable Violet Dye) e posteriormente com CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Finalmente, as células serão lavadas e ressuspensas em PBS paraformaldeído a 1%.

Um Índice de Proliferação Celular (CPI) para células T expandidas específicas de antígeno será determinado subtraindo a porcentagem de CD25+ICOS+ CD3+CD4+ ou CD3+CD8+ detectada em PBMC incubadas com peptídeos de actina da porcentagem de células T CD25+ICOS+ subconjuntos detectados em PBMC incubados com peptídeos de HPV. Um IPC <1,5% será considerado negativo enquanto um valor ≥1,5% será considerado positivo.

As análises de citometria de fluxo foram realizadas com um citômetro de fluxo FACS Canto II e software BD DIVA.

Para a análise das características relacionadas ao HPV, serão utilizadas abordagens moleculares. O DNA do HPV será extraído de biópsias e swabs de lesões utilizando sistemas automatizados após tratamento de lise específico para tecidos.

O DNA do HPV será então quantificado utilizando PCR em tempo real específico para regiões L1/E2 e E6; em detalhes será utilizado o fragmento MY 09/11 do gene L1. Os resultados serão expressos como o número de cópias/100.000 células e normalizados usando um gene de limpeza.

Para a quantificação diferencial de DNA de HPV integrado ou epissomal será utilizado um sistema padronizado específico para amplificação de ORF E2 e E6.