子宮頸部持続感染および発癌の HPV 免疫学的マーカー (HPVImmuno)

この研究の最終目標は、リスク層別化と患者に合わせた治療法を定義するために、扁平上皮内病変（SIL）の発症と進行に影響を与えるウイルス特異的免疫やHPV関連パラメータなどの宿主因子を分析し、広く利用可能で非効率的な治療法を開発することである。 -侵襲的アッセイによる高い的中率の免疫スコア。

異常なパプスメアを有する女性における2年後の扁平上皮内病変（H SIL）の進行も評価され（主要評価項目）、扁平上皮内病変を有する女性および抗HPVワクチン接種後の免疫宿主プロフィールも評価される予定である。感染の持続性が分析されます（二次エンドポイント）。

私たちは、診断後最長 2 年まで 6 か月ごとに、パプスメア異常を認めて前向きに登録された患者を分析します。 各時点で、コルポスコピー中に、局所および末梢免疫応答の特性評価のために、末梢血 (30 mL) および子宮頸部サンプル (膣洗浄、子宮頸部生検およびパプスメア) が収集されます。 ウイルス量、HPV の組み込みは、診断および/または治癒手術時に患者から採取した細胞学的および組織サンプルで評価されます。

二次評価項目として、HPV 感染が確認され、治療用および予防用の HPV ワクチン接種を受けている患者を登録します。 ワクチン接種はHPV病変の診断後直ちに実施されます。 フォローアップ プログラムでは、2 年間にわたって 6 か月ごとにコルポスコピーが行われます。 HPV特異的免疫反応を6か月ごとに分析し、診断時と追跡調査終了時のウイルス量とHPVの組み込みを分析します。

抗原特異的増殖応答を評価するために、HPV-16および-18の抗原L1、E6、E7タンパク質およびヒトアクチンペプチドプールを用いて、96ウェル丸底プレート内でPBMCを3連で7日間刺激します。 培地は、2 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリンおよび 100 μg/mL ストレプトマイシン溶液、10% の熱不活化 FBS、1 mM ピルビン酸ナトリウム、100 μM 非必須アミノ酸、および 50 μM 2 を添加した RPMI 1640 でした。 -メルカプトエタノール。 培養後、細胞を洗浄し、Live/Dead Fixable Violet Dye で染色し、続いて CD3、CD4、CD8、CD25、CD278 (ICOS) で染色します。 最後に、細胞を洗浄し、1% パラホルムアルデヒドを含む PBS に再懸濁します。

抗原特異的に増殖した T 細胞の細胞増殖指数 (CPI) は、CD25+ICOS+ T 細胞のパーセンテージから、アクチン ペプチドとインキュベートした PBMC で検出された CD25+ICOS+ CD3+CD4+ または CD3+CD8+ のパーセンテージを差し引くことによって決定されます。 HPVペプチドとインキュベートしたPBMCで検出されたサブセット。 CPI <1.5% はマイナスとみなされ、値 ≥1.5% はプラスとみなされます。

フローサイトメトリー分析は、FACS Canto II フローサイトメーターおよび BD DIVA ソフトウェアを使用して実行されました。

HPV関連の特徴の解析には、分子的アプローチが使用されます。 HPV DNAは、組織に対する特別な溶解処理の後、自動化システムを使用して生検材料および病変綿棒から抽出されます。

次に、L1/E2 および E6 領域に特異的なリアルタイム PCR を使用して HPV DNA を定量します。詳細には、L1 遺伝子の MY 09/11 フラグメントが使用されます。 結果はコピー数/100,000細胞として表され、ハウスキーピング遺伝子を使用して正規化されます。

組み込まれた HPV DNA またはエピソーム HPV DNA の示差定量には、ORF E2 および E6 の増幅のための特定の標準化システムが使用されます。