Marcatori immunologici HPV di infezione persistente cervicale e oncogenesi (HPVImmuno)

Il punto finale di questo studio è quello di analizzare i fattori dell'ospite, tra cui l'immunità virus-specifica e i parametri correlati all'HPV che influenzano l'insorgenza e la progressione della lesione intraepiteliale squamosa (SIL), al fine di definire la stratificazione del rischio e personalizzare il trattamento, sviluppando un trattamento ampiamente accessibile e non -test invasivi immunoscore con alto valore predittivo.

Verrà inoltre valutata la progressione della lesione intraepiteliale squamosa (H SIL) a 2 anni in donne con pap test anomalo (endpoint primario) e il profilo immunitario dell'ospite dopo vaccinazione profilattica e terapeutica anti-HPV, in donne con lesioni intraepiteliali squamose e con verrà analizzata la persistenza dell'infezione (endpoint secondario).

Analizzeremo i pazienti, arruolati in modo prospettico con pap test anomalo ogni sei mesi fino a due anni dopo la diagnosi. Ad ogni momento, durante la colposcopia, verranno raccolti campioni di sangue periferico (30 mL) e campioni cervicali (lavaggio vaginale, biopsia cervicale e pap-test) per la caratterizzazione della risposta immunitaria locale e periferica. La carica virale e l'integrazione dell'HPV saranno valutate su campioni citologici e tissutali ottenuti dai pazienti al momento della diagnosi e/o dell'intervento chirurgico curativo.

Per gli endpoint secondari, arruoleremo pazienti con infezione da HPV confermata, sottoposti a vaccinazione terapeutica e profilattica contro l'HPV. La vaccinazione verrà eseguita immediatamente dopo la diagnosi della lesione da HPV. Il programma di follow-up prevede la colposcopia ogni sei mesi per 2 anni. Analizzeremo la risposta immunitaria specifica per l'HPV ogni sei mesi, la carica virale e l'integrazione dell'HPV al momento della diagnosi e alla fine del follow-up.

Per valutare la risposta proliferativa antigene-specifica, le PBMC saranno stimolate in triplicato in piastre a fondo tondo da 96 pozzetti con antigeni proteine ​​L1, E6, E7 dell'HPV-16 e -18 e pool di peptidi di actina umana per 7 giorni. Il terreno di coltura era RPMI 1640 integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U/mL di penicillina e 100 µg/mL di soluzione di streptomicina, 10% di FBS inattivato al calore, 1 mM di piruvato di sodio, 100 µM di aminoacidi non essenziali e 50 µM 2 -Mercaptoetanolo. Dopo la coltura, le cellule verranno lavate, colorate con Live/Dead Fixable Violet Dye e successivamente con CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Infine, le cellule verranno lavate e risospese in PBS paraformaldeide all'1%.

Un indice di proliferazione cellulare (CPI) per le cellule T espanse antigene-specifiche sarà determinato sottraendo la percentuale di CD25+ICOS+ CD3+CD4+ o CD3+CD8+ rilevata in PBMC incubati con peptidi di actina dalla percentuale di cellule T CD25+ICOS+ sottoinsiemi rilevati in PBMC incubati con peptidi HPV. Un CPI <1,5% sarà considerato negativo mentre un valore ≥1,5% sarà considerato positivo.

Le analisi di citometria a flusso sono state eseguite con un citometro a flusso FACS Canto II e il software BD DIVA.

Per l'analisi delle caratteristiche correlate all'HPV verranno utilizzati approcci molecolari. Il DNA dell'HPV verrà estratto dalle biopsie e dai tamponi delle lesioni utilizzando sistemi automatizzati dopo trattamento di lisi specifico per i tessuti.

Il DNA dell'HPV sarà poi quantificato mediante real time PCR specifica per le regioni L1/E2 ed E6; in dettaglio verrà utilizzato il frammento MY 09/11 del gene L1. I risultati saranno espressi come numero di copie/100.000 cellule e normalizzati utilizzando un gene housekeeping.

Per la quantificazione differenziale del DNA dell'HPV integrato o episomiale verrà utilizzato uno specifico sistema standardizzato per l'amplificazione dell'ORF E2 ed E6.