HPV immunologiske markører for cervikal vedvarende infektion og onkogenese (HPVImmuno)

Slutpunktet for denne undersøgelse er at analysere værtsfaktorer, herunder virusspecifik immunitet og HPV-relaterede parametre, der påvirker starten og progressionen af ​​pladeepitellæsioner (SIL), for at definere risikostratificering og skræddersy behandling, udvikling af bredt tilgængelig og ikke -invasive assays immunscore med høj prædiktiv værdi.

Progressionen af ​​pladeepitellæsion (H SIL) efter 2 år hos kvinder med unormal pap-smear vil også blive evalueret (primært slutpunkt) og immunværtsprofilen efter anti-HPV profylaktisk og terapeutisk vaccination, hos kvinder med pladeepitellæsioner og med infektionens persistens vil blive analyseret (sekundært slutpunkt).

Vi vil analysere patienterne, der er indskrevet prospektivt med unormal celleprøve hver sjette måned op til to år efter diagnosen. På hvert tidspunkt, under kolposkopi, vil perifert blod (30 ml) og cervikale prøver (vaginal vask, cervikal biopsi og pap-smear) blive indsamlet til karakterisering af lokal og perifer immunrespons. Viral belastning, HPV-integration vil blive vurderet på cytologiske prøver og vævsprøver opnået fra patienterne på tidspunktet for diagnose og/eller helbredende kirurgi.

For de sekundære endepunkter vil vi indskrive patienter med bekræftet HPV-infektion, som gennemgår terapeutisk og profylaktisk HPV-vaccination. Vaccinationen vil blive udført umiddelbart efter HPV-læsionsdiagnose. Opfølgningsprogram indebærer kolposkopi hver sjette måned i 2 år. Vi vil analysere HPV-specifikt immunrespons hvert halve år, og viral load og HPV-integration på diagnosetidspunktet og ved opfølgningens afslutning.

For at evaluere antigen-specifikt proliferativt respons vil PBMC'er blive stimuleret i tre eksemplarer i 96-brønds rundbundede plader med antigener L1, E6, E7 proteiner af HPV-16 og -18 og human Actin peptid pools i 7 dage. Dyrkningsmediet var RPMI 1640 suppleret med 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycinopløsning, 10% varmeinaktiveret FBS, 1 mM natriumpyruvat, 100 µM ikke-essentielle 52 aminosyrer og µM aminosyrer. -Mercaptoethanol. Efter dyrkning vil cellerne blive vasket, farvet med Live/Dead Fixable Violet Dye) og efterfølgende med CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Til sidst vil cellerne blive vasket og resuspenderet i PBS 1% paraformaldehyd.

Et celleproliferationsindeks (CPI) for antigenspecifikke ekspanderede T-celler vil blive bestemt ved at trække procentdelen af ​​CD25+ICOS+ CD3+CD4+ eller CD3+CD8+ påvist i PBMC inkuberet med actinpeptider fra procentdelen af ​​CD25+ICOS+ T-celler undersæt påvist i PBMC inkuberet med HPV-peptider. En CPI <1,5% vil blive betragtet som negativ, mens en værdi ≥1,5% vil blive betragtet som positiv.

Flowcytometrianalyser blev udført med et FACS Canto II flowcytometer og BD DIVA-software.

Til analyse af HPV-relaterede funktioner vil molekylære tilgange blive brugt. HPV-DNA vil blive ekstraheret fra biopsier og læsionspodninger ved hjælp af automatiserede systemer efter specifik lysisbehandling af væv.

HPV DNA vil derefter blive kvantificeret ved anvendelse af real-time PCR, der er specifik for L1/E2 og E6 regioner; i detaljer MY 09/11 fragment af L1 gen vil blive brugt. Resultaterne vil blive udtrykt som antallet af kopier/100.000 celler og normaliseret ved hjælp af et husholdningsgen.

Til differentiel kvantificering af integreret eller episomalt HPV DNA vil et specifikt standardiseret system til amplifikation af ORF E2 og E6 blive brugt.