Immunologiczne markery HPV trwałej infekcji szyjki macicy i onkogenezy (HPVImmuno)

Końcowym punktem tego badania jest analiza czynników gospodarza, w tym odporności swoistej dla wirusa i parametrów związanych z HPV wpływających na początek i progresję śródnabłonkowej zmiany płaskonabłonkowej (SIL), w celu określenia stratyfikacji ryzyka i dostosowania leczenia, opracowania szeroko dostępnych i nieinwazyjnych -inwazyjne testy immunologiczne o wysokiej wartości predykcyjnej.

Oceniona zostanie również progresja zmian śródnabłonkowych płaskonabłonkowych (H SIL) po 2 latach u kobiet z nieprawidłowym rozmazem wymazu (główny punkt końcowy) oraz profil odpornościowy gospodarza po szczepieniu profilaktycznym i terapeutycznym przeciwko HPV, u kobiet ze zmianami śródnabłonkowymi płaskonabłonkowymi i analizowana będzie trwałość infekcji (drugorzędowy punkt końcowy).

Przeanalizujemy pacjentów włączanych prospektywnie z nieprawidłowym wymazem co sześć miesięcy do dwóch lat od diagnozy. W każdym momencie podczas kolposkopii pobierana będzie krew obwodowa (30 ml) i próbki z szyjki macicy (popłuczyny z pochwy, biopsja szyjki macicy i wymaz z szyjki macicy) w celu scharakteryzowania lokalnej i obwodowej odpowiedzi immunologicznej. Miano wirusa i integracja HPV zostaną ocenione na próbkach cytologicznych i tkankach pobranych od pacjentów w momencie diagnozy i/lub zabiegu chirurgicznego.

Do drugorzędowych punktów końcowych będziemy włączać pacjentów z potwierdzonym zakażeniem HPV, poddawanych szczepieniom terapeutycznym i profilaktycznym przeciwko HPV. Szczepienie zostanie wykonane natychmiast po rozpoznaniu zmiany HPV. Program kontroli obejmuje kolposkopię co sześć miesięcy przez 2 lata. Co sześć miesięcy będziemy analizować odpowiedź immunologiczną specyficzną dla HPV oraz miano wirusa i integrację HPV w momencie diagnozy i na koniec okresu obserwacji.

W celu oceny odpowiedzi proliferacyjnej specyficznej dla antygenu, PBMC będą stymulowane w trzech powtórzeniach na 96-studzienkowych płytkach okrągłodennych białkami antygenami L1, E6, E7 HPV-16 i -18 oraz pulami ludzkiego peptydu aktyny przez 7 dni. Pożywką hodowlaną było RPMI 1640 uzupełnione 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml roztworu streptomycyny, 10% inaktywowanego termicznie FBS, 1 mM pirogronianu sodu, 100 µM nieistotnych aminokwasów i 50 µM2 -Merkaptoetanol. Po hodowli komórki zostaną przemyte, wybarwione żywym/martwym utrwalalnym fioletowym barwnikiem), a następnie CD3, CD4, CD8, CD25, CD278 (ICOS). Na koniec komórki zostaną przemyte i ponownie zawieszone w 1% paraformaldehydzie PBS.

Wskaźnik proliferacji komórek (CPI) dla ekspandowanych komórek T specyficznych dla antygenu zostanie określony poprzez odjęcie procentu komórek T CD25+ICOS+ CD3+CD4+ lub CD3+CD8+ wykrytych w PBMC inkubowanych z peptydami aktynowymi od procentu komórek T CD25+ICOS+ podzbiory wykryte w PBMC inkubowanych z peptydami HPV. CPI <1,5% zostanie uznane za ujemne, a wartość ≥1,5% zostanie uznane za dodatnie.

Analizy metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego FACS Canto II i oprogramowania BD DIVA.

Do analizy cech związanych z HPV zastosowane zostaną podejścia molekularne. DNA HPV będzie ekstrahowane z biopsji i wymazów ze zmian chorobowych przy użyciu zautomatyzowanych systemów, po specjalnej lizie tkanek.

Następnie DNA HPV zostanie określone ilościowo przy użyciu reakcji PCR w czasie rzeczywistym specyficznej dla regionów L1/E2 i E6; szczegółowo zostanie użyty fragment genu L1 MY 09/11. Wyniki zostaną wyrażone jako liczba kopii/100 000 komórek i znormalizowane przy użyciu genu metabolizmu podstawowego.

Do różnicowego oznaczania ilościowego zintegrowanego lub episomalnego DNA HPV zastosowany zostanie specyficzny, standaryzowany system amplifikacji ORF E2 i E6.