Vliv probiotik na střevní bakteriální populaci a imunitní modulaci

Některé klinické parametry byly hodnoceny podle následujícího: primární výsledek (závažnost průjmu) a sekundární výsledek včetně změny tělesné hmotnosti, chuti k jídlu a denního příjmu, nadýmání nebo abdominální distenze, bolesti břicha nebo koliky, zácpa, horečka a zvracení. .

Periferní krev izolovaná pomocí Lymphoprep, promytá dvakrát normálním fyziologickým roztokem a jednou médiem a suspendována v médiu [RPMI 1640] na hustotu 1 x 106/ml. PBMC budou izolovány z buffy coats dárce krve centrifugací v hustotním gradientu. Koncentrace PBMC se upraví na 106 buněk na ml v kompletním médiu a buňky se přenesou na 24jamkové destičky. Exprese fenotypu buněčného povrchu a intracelulární barvení. Buňky budou barveny pomocí panelu monoklonálních protilátek (MAb) namířených proti povrchovým antigenům exprimovaným lymfocyty, monocyty a vhodnými kontrolami izotypu G imunoglobulinu specifického pro daný druh. Buňky budou získány pomocí FACScan (Becton Dickinson) a analyzovány pomocí softwaru Cell Quest.

Pro posouzení kolonizace střevních bakterií byly od každého pacienta odebrány vzorky stolice v den 0 (den, kdy byli pacienti zařazeni), den 3 a den 7 po léčbě probiotiky nebo placebem. Vzorky stolice byly zváženy, homogenizovány a sériově zředěny a naneseny na selektivní agar pro analýzu bakterií. Počet fekálních bakterií byl vyjádřen jako log10 CFU/g stolice.

Vzorky stolice byly odebírány během období léčby. Hladiny IgA byly stanoveny na homogenizovaných vzorcích stolice. Celkový IgA byl stanoven pomocí konjugátu kozího anti-lidského IgA-HRP. Reakce byla vyvolána tetramethylbenzidinem (TMB; Zymed Labs.) a odečtena při 450 nm. Hodnoty OD byly převedeny na ng/g stolice celkového IgA srovnáním se standardní křivkou vyvinutou s anti-lidským IgA.

Vzorky stolice byly připraveny a analyzovány na laktoferin. Polyklonální protilátka specifická pro laktoferin byla předem nanesena na mikrodestičku. Laktoferin ve standardech a vzorcích je propojen s imobilizovanou protilátkou a biotinylovanou polyklonální protilátkou specifickou pro laktoferin, která je rozpoznána konjugátem streptavidin-peroxidáza. Absorbance se odečítá při OD 450 nm. Laktoferin byl vyjádřen jako μg/g stolice.

Vzorky stolice byly připraveny a analyzovány na kalprotektin. Supernatant se shromáždil a zmrazil při -20 °C. Supernatanty byly rozmraženy a kalprotektin byl analyzován pomocí kvantitativního kalprotektinu ELISA a odečten při OD 450 nm. Kalprotektin byl vyjádřen jako μg/g stolice.