Effetto dei probiotici sulla popolazione batterica intestinale e sulla modulazione immunitaria

Alcuni parametri clinici sono stati valutati in base a quanto segue: sono stati valutati anche l'esito primario (gravità della diarrea) e l'esito secondario comprendente variazione del peso corporeo, appetito e assunzione giornaliera, gonfiore o distensione addominale, dolore addominale o coliche, costipazione, febbre e vomito .

Sangue periferico isolato da Lymphoprep, lavato due volte in soluzione fisiologica normale e una volta in terreno e sospeso in terreno [RPMI 1640] a una densità di 1 x 106/mL. Le PBMC saranno isolate dai buffy coat di donatori di sangue mediante centrifugazione in gradiente di densità. La concentrazione di PBMC sarà regolata a 106 cellule per ml in terreno completo e le cellule saranno trasferite in piastre da 24 pozzetti. Espressione del fenotipo della superficie cellulare e colorazione intracellulare. Le cellule saranno colorate utilizzando un pannello di anticorpo monoclonale (MAb) diretto contro antigeni di superficie espressi da linfociti, monociti e gli appropriati controlli di isotipo dell'immunoglobulina G specie-specifica. Le cellule saranno acquisite utilizzando un FACScan (Becton Dickinson) e analizzate con il software Cell Quest.

Per valutare la colonizzazione dei batteri intestinali, sono stati raccolti campioni fecali da ciascun paziente il giorno 0 (il giorno in cui i pazienti sono stati arruolati), il giorno 3 e il giorno 7 dopo il trattamento con probiotici o placebo. I campioni fecali sono stati pesati, omogeneizzati e diluiti in serie e piastrati su agar selettivo per l'analisi dei batteri. La conta dei batteri fecali è stata espressa come log10 CFU/g di feci.

I campioni fecali sono stati raccolti durante il periodo di trattamento. I livelli di IgA sono stati eseguiti su campioni fecali omogeneizzati. Le IgA totali sono state determinate utilizzando il coniugato anti-IgA umana-HRP di capra. La reazione è stata sviluppata con tetrametil benzidina (TMB; Zymed Labs.) e letta a 450 nm. I valori di OD sono stati convertiti in ng/g di feci di IgA totale rispetto a una curva standard sviluppata con IgA anti-umana.

I campioni di feci sono stati preparati e analizzati per la lattoferrina. Un anticorpo policlonale specifico per la lattoferrina è stato pre-rivestito su una micropiastra. La lattoferrina negli standard e nei campioni è racchiusa tra l'anticorpo immobilizzato e un anticorpo policlonale biotinilato specifico per la lattoferrina, riconosciuto da un coniugato streptavidina-perossidasi. L'assorbanza viene letta a OD 450 nm. La lattoferrina è stata espressa come μg/g di feci.

I campioni di feci sono stati preparati e analizzati per la calprotectina. Il surnatante è stato raccolto e congelato a -20°C. I surnatanti sono stati scongelati e la calprotectina è stata analizzata con l'ELISA quantitativo della calprotectina e letta a OD 450 nm. La calprotectina è stata espressa come μg/g di feci.