Effekt av probiotika på tarmbakteriepopulasjon og immunmodulering

Noen kliniske parametere ble evaluert i henhold til følgende: primært utfall (alvorlighetsgrad av diaré), og sekundært utfall inkludert kroppsvektsendring, appetitt og daglig inntak, oppblåsthet eller abdominal distensjon, magesmerter eller kolikk, forstoppelse, feber og oppkast ble også vurdert .

Perifert blod isolert av Lymphoprep, vasket to ganger i vanlig saltvann og en gang i medium, og suspendert i medium [RPMI 1640] til en tetthet på 1 x 106/ml. PBMC-er vil bli isolert fra blodgiver-buffy coats ved tetthetsgradientsentrifugering. Konsentrasjonen av PBMC-er vil bli justert til 106 celler per ml i komplett medium, og cellene vil bli overført til 24-brønners plater. Celleoverflate-fenotypeekspresjon og intracellulær farging. Celler vil bli farget ved hjelp av et panel av monoklonalt antistoff (MAb) rettet mot overflateantigener uttrykt av lymfocytter, monocytter og passende artsspesifikke immunoglobulin G isotypekontroller. Celler vil bli anskaffet ved hjelp av en FACScan (Becton Dickinson) og analysert med Cell Quest-programvare.

For å vurdere koloniseringen av tarmbakterier ble det samlet inn fekale prøver fra hver pasient på dag 0 (dagen da pasientene ble innrullert), dag 3 og dag 7 etter probiotika eller placebobehandling. De fekale prøvene ble veid, homogenisert og seriefortynnet og utsådd på selektiv agar for analyse av bakterier. Antall avføringsbakterier ble uttrykt som log10 CFU/g avføring.

Avføringsprøver ble samlet inn i løpet av behandlingsperioden. IgA-nivåer ble utført på homogeniserte fekale prøver. Totalt IgA ble bestemt ved å bruke geite-anti-humant IgA-HRP-konjugat. Reaksjonen ble utviklet med tetrametylbenzidin (TMB; Zymed Labs.) og avlest ved 450 nm. OD-verdier ble konvertert til ng/g feces av total IgA ved sammenligning med en standardkurve utviklet med anti-humant IgA.

Avføringsprøvene ble klargjort og analysert for laktoferrin. Et polyklonalt antistoff spesifikt for laktoferrin har blitt pre-belagt på en mikroplate. Laktoferrin i standarder og prøver er klemt sammen av det immobiliserte antistoffet og et biotinylert polyklonalt antistoff spesifikt for laktoferrin, som gjenkjennes av et streptavidin-peroksidase-konjugat. Absorbansen avleses ved OD 450 nm. Laktoferrin ble uttrykt som μg/g feces.

Avføringsprøvene ble klargjort og analysert for calprotectin. Supernatanten ble samlet og frosset ved -20°C. Supernatantene ble tint og calprotectin ble analysert med den kvantitative calprotectin ELISA og avlest ved OD 450 nm. Calprotectin ble uttrykt som μg/g feces.