Effet des probiotiques sur la population bactérienne intestinale et la modulation immunitaire

Certains paramètres cliniques ont été évalués selon les critères suivants : le résultat primaire (sévérité de la diarrhée) et le résultat secondaire, y compris la modification du poids corporel, l'appétit et l'apport quotidien, les ballonnements ou la distension abdominale, les douleurs abdominales ou les coliques, la constipation, la fièvre et les vomissements ont également été évalués. .

Sang périphérique isolé par Lymphoprep, lavé deux fois dans une solution saline normale et une fois dans du milieu, et mis en suspension dans du milieu [RPMI 1640] à une densité de 1 x 106/mL. Les PBMC seront isolées des couches leucocytaires des donneurs de sang par centrifugation en gradient de densité. La concentration de PBMC sera ajustée à 106 cellules par ml en milieu complet, et les cellules seront transférées dans des plaques 24 puits. Expression du phénotype de surface cellulaire et coloration intracellulaire. Les cellules seront colorées à l'aide d'un panel d'anticorps monoclonaux (MAb) dirigés contre les antigènes de surface exprimés par les lymphocytes, les monocytes et les contrôles appropriés d'isotype d'immunoglobuline G spécifiques à l'espèce. Les cellules seront acquises à l'aide d'un FACScan (Becton Dickinson) et analysées avec le logiciel Cell Quest.

Pour évaluer la colonisation des bactéries intestinales, des échantillons fécaux ont été prélevés sur chaque patient au jour 0 (le jour où les patients ont été recrutés), au jour 3 et au jour 7 après le traitement probiotique ou placebo. Les échantillons fécaux ont été pesés, homogénéisés et dilués en série et étalés sur de l'agar sélectif pour l'analyse des bactéries. Le nombre de bactéries fécales a été exprimé en log10 UFC/g de matières fécales.

Des échantillons fécaux ont été prélevés pendant la période de traitement. Les niveaux d'IgA ont été effectués sur des échantillons fécaux homogénéisés. Les IgA totales ont été déterminées à l'aide d'un conjugué de chèvre anti-humain IgA-HRP. La réaction a été développée avec de la tétraméthylbenzidine (TMB; Zymed Labs.) et lue à 450 nm. Les valeurs de DO ont été converties en ng/g de matières fécales d'IgA totales par comparaison avec une courbe standard développée avec des IgA anti-humaines.

Les échantillons de selles ont été préparés et analysés pour la lactoferrine. Un anticorps polyclonal spécifique de la lactoferrine a été pré-enduit sur une microplaque. La lactoferrine dans les standards et les échantillons est prise en sandwich par l'anticorps immobilisé et un anticorps polyclonal biotinylé spécifique de la lactoferrine, qui est reconnu par un conjugué streptavidine-peroxydase. L'absorbance est lue à DO 450 nm. La lactoferrine a été exprimée en μg/g de matières fécales.

Les échantillons de selles ont été préparés et analysés pour la calprotectine. Le surnageant a été récupéré et congelé à -20°C. Les surnageants ont été décongelés et la calprotectine a été analysée avec l'ELISA quantitatif de la calprotectine et lue à DO 450 nm. La calprotectine a été exprimée en μg/g de matières fécales.