Effect van probiotica op darmbacteriënpopulatie en immuunmodulatie

Sommige klinische parameters werden als volgt beoordeeld: primaire uitkomst (ernst van diarree) en secundaire uitkomst, waaronder verandering van het lichaamsgewicht, eetlust en dagelijkse inname, opgeblazen gevoel of opgezette buik, buikpijn of koliek, constipatie, koorts en braken werden ook beoordeeld .

Perifeer bloed geïsoleerd door Lymphoprep, tweemaal gewassen in normale zoutoplossing en eenmaal in medium, en gesuspendeerd in medium [RPMI 1640] tot een dichtheid van 1 x 106/ml. PBMC's zullen worden geïsoleerd uit buffy coats van bloeddonoren door centrifugatie met een dichtheidsgradiënt. De concentratie van PBMC's zal worden aangepast tot 106 cellen per ml in volledig medium en de cellen zullen worden overgebracht naar platen met 24 putjes. Fenotype-expressie van het celoppervlak en intracellulaire kleuring. Cellen zullen worden gekleurd met behulp van een paneel van monoklonaal antilichaam (MAb) gericht tegen oppervlakte-antigenen die tot expressie worden gebracht door lymfocyten, monocyten en de geschikte soortspecifieke immunoglobuline G-isotypecontroles. Cellen worden verkregen met behulp van een FACScan (Becton Dickinson) en geanalyseerd met Cell Quest-software.

Om de kolonisatie van darmbacteriën te beoordelen, werden fecale monsters van elke patiënt verzameld op dag 0 (de dag waarop patiënten werden ingeschreven), dag 3 en dag 7 na behandeling met probiotica of placebo. De fecale monsters werden gewogen, gehomogeniseerd en serieel verdund en uitgeplaat op selectieve agar voor analyse van bacteriën. Het aantal fecale bacteriën werd uitgedrukt als log10 CFU/g feces.

Fecale monsters werden verzameld tijdens de behandelingsperiode. IgA-niveaus werden uitgevoerd op gehomogeniseerde fecale monsters. Totaal IgA werd bepaald met behulp van geit-anti-humaan IgA-HRP-conjugaat. De reactie werd ontwikkeld met tetramethylbenzidine (TMB; Zymed Labs.) en afgelezen bij 450 nm. OD-waarden werden omgezet in ng/g ontlasting van totaal IgA door vergelijking met een standaardcurve ontwikkeld met anti-humaan IgA.

De ontlastingsmonsters werden bereid en geanalyseerd op lactoferrine. Een polyklonaal antilichaam dat specifiek is voor lactoferrine is vooraf gecoat op een microplaat. Lactoferrine in standaarden en monsters wordt ingeklemd door het geïmmobiliseerde antilichaam en een gebiotinyleerd polyklonaal antilichaam specifiek voor lactoferrine, dat wordt herkend door een streptavidine-peroxidase-conjugaat. Absorptie wordt afgelezen bij OD 450 nm. Lactoferrine werd uitgedrukt als μg/g ontlasting.

De ontlastingsmonsters werden bereid en geanalyseerd op calprotectine. Het supernatant werd verzameld en ingevroren bij -20°C. De supernatanten werden ontdooid en calprotectine werd geanalyseerd met de kwantitatieve calprotectine-ELISA en afgelezen bij OD 450 nm. Calprotectine werd uitgedrukt als μg/g ontlasting.