Efecto de los probióticos sobre la población bacteriana intestinal y la modulación inmunitaria

Se evaluaron algunos parámetros clínicos de acuerdo con lo siguiente: resultado primario (gravedad de la diarrea) y resultado secundario que incluye cambio de peso corporal, apetito e ingesta diaria, hinchazón o distensión abdominal, dolor abdominal o cólico, estreñimiento, fiebre y vómitos. .

Sangre periférica aislada con Lymphoprep, lavada dos veces en solución salina normal y una vez en medio, y suspendida en medio [RPMI 1640] hasta una densidad de 1 x 106/mL. Las PBMC se aislarán de las capas leucocitarias del donante de sangre mediante centrifugación en gradiente de densidad. La concentración de PBMC se ajustará a 106 células por ml en medio completo y las células se transferirán a placas de 24 pocillos. Expresión del fenotipo de la superficie celular y tinción intracelular. Las células se tiñerán utilizando un panel de anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos contra los antígenos de superficie expresados ​​por linfocitos, monocitos y los controles de isotipo de inmunoglobulina G específicos de especies apropiados. Las células se adquirirán usando un FACScan (Becton Dickinson) y se analizarán con el software Cell Quest.

Para evaluar la colonización de bacterias intestinales, se recolectaron muestras fecales de cada paciente el día 0 (el día en que se inscribieron los pacientes), el día 3 y el día 7 después del tratamiento con probióticos o placebo. Las muestras fecales se pesaron, homogeneizaron y diluyeron en serie y se sembraron en agar selectivo para el análisis de bacterias. El recuento de bacterias fecales se expresó como log10 CFU/g de heces.

Se recogieron muestras fecales durante el período de tratamiento. Los niveles de IgA se realizaron en muestras fecales homogeneizadas. La IgA total se determinó utilizando conjugado de IgA-HRP anti-humano de cabra. La reacción se desarrolló con tetrametil bencidina (TMB; Zymed Labs.) y se leyó a 450 nm. Los valores de DO se convirtieron a ng/g de heces de IgA total en comparación con una curva estándar desarrollada con IgA antihumana.

Las muestras de heces se prepararon y analizaron para detectar lactoferrina. Un anticuerpo policlonal específico para la lactoferrina se recubrió previamente en una microplaca. La lactoferrina en los estándares y las muestras está intercalada por el anticuerpo inmovilizado y un anticuerpo policlonal biotinilado específico para la lactoferrina, que es reconocido por un conjugado de estreptavidina-peroxidasa. La absorbancia se lee a una DO de 450 nm. La lactoferrina se expresó como μg/g de heces.

Las muestras de heces se prepararon y analizaron para calprotectina. El sobrenadante se recogió y se congeló a -20°C. Los sobrenadantes se descongelaron y la calprotectina se analizó con el ELISA de calprotectina cuantitativa y se leyó a una DO de 450 nm. La calprotectina se expresó como μg/g de heces.