Wirkung von Probiotika auf die Darmbakterienpopulation und die Immunmodulation

Einige klinische Parameter wurden wie folgt bewertet: Primärer Endpunkt (Schweregrad des Durchfalls) und sekundärer Endpunkt, einschließlich Körpergewichtsveränderung, Appetit und tägliche Einnahme, Blähungen oder aufgeblähter Bauch, Bauchschmerzen oder Koliken, Verstopfung, Fieber und Erbrechen wurden ebenfalls bewertet .

Peripheres Blut, isoliert durch Lymphoprep, zweimal in normaler Kochsalzlösung und einmal in Medium gewaschen und in Medium [RPMI 1640] auf eine Dichte von 1 x 106/ml suspendiert. PBMCs werden aus Buffy Coats von Blutspendern durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Konzentration von PBMCs wird auf 106 Zellen pro ml in Vollmedium eingestellt, und die Zellen werden auf Platten mit 24 Vertiefungen übertragen. Expression des Zelloberflächenphänotyps und intrazelluläre Färbung. Die Zellen werden mit einem Panel aus monoklonalen Antikörpern (MAb) gefärbt, die gegen Oberflächenantigene gerichtet sind, die von Lymphozyten, Monozyten und den entsprechenden speziesspezifischen Immunglobulin-G-Isotyp-Kontrollen exprimiert werden. Die Zellen werden mit einem FACScan (Becton Dickinson) erfasst und mit der Cell Quest-Software analysiert.

Um die Kolonisierung von Darmbakterien zu beurteilen, wurden von jedem Patienten am Tag 0 (dem Tag, an dem die Patienten aufgenommen wurden), Tag 3 und Tag 7 nach der Behandlung mit Probiotika oder Placebo Stuhlproben entnommen. Die Kotproben wurden gewogen, homogenisiert und seriell verdünnt und auf selektivem Agar zur Analyse von Bakterien ausplattiert. Die Bakterienzahl im Stuhl wurde als log10 CFU/g Kot ausgedrückt.

Während der Behandlungsdauer wurden Kotproben gesammelt. IgA-Spiegel wurden an homogenisierten Stuhlproben gemessen. Gesamt-IgA wurde unter Verwendung von Ziegen-Anti-Mensch-IgA-HRP-Konjugat bestimmt. Die Reaktion wurde mit Tetramethylbenzidin (TMB; Zymed Labs.) entwickelt und bei 450 nm abgelesen. OD-Werte wurden durch Vergleich mit einer mit Anti-Human-IgA entwickelten Standardkurve in ng/g Kot von Gesamt-IgA umgewandelt.

Die Stuhlproben wurden aufbereitet und auf Lactoferrin analysiert. Eine Mikroplatte wurde mit einem für Lactoferrin spezifischen polyklonalen Antikörper vorbeschichtet. Lactoferrin in Standards und Proben ist sandwichartig zwischen dem immobilisierten Antikörper und einem biotinylierten polyklonalen Antikörper eingeschlossen, der spezifisch für Lactoferrin ist, das von einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat erkannt wird. Die Extinktion wird bei OD 450 nm abgelesen. Lactoferrin wurde als μg/g Kot ausgedrückt.

Die Stuhlproben wurden aufbereitet und auf Calprotectin analysiert. Der Überstand wurde gesammelt und bei –20°C eingefroren. Die Überstände wurden aufgetaut und Calprotectin wurde mit dem quantitativen Calprotectin-ELISA analysiert und bei OD 450 nm abgelesen. Calprotectin wurde als μg/g Kot ausgedrückt.