Efeito dos probióticos na população bacteriana intestinal e modulação imunológica

Alguns parâmetros clínicos foram avaliados de acordo com o seguinte: desfecho primário (gravidade da diarreia) e desfecho secundário, incluindo alteração de peso corporal, apetite e ingestão diária, inchaço ou distensão abdominal, dor ou cólica abdominal, constipação, febre e vômito também foram avaliados .

Sangue periférico isolado por Lymphoprep, lavado duas vezes em solução salina normal e uma vez em meio, e suspenso em meio [RPMI 1640] a uma densidade de 1 x 106/mL. PBMCs serão isoladas de buffy coats de doadores de sangue por centrifugação em gradiente de densidade. A concentração de PBMCs será ajustada para 106 células por ml em meio completo, e as células serão transferidas para placas de 24 poços. Expressão do fenótipo da superfície celular e coloração intracelular. As células serão coradas usando um painel de anticorpo monoclonal (MAb) direcionado contra antígenos de superfície expressos por linfócitos, monócitos e os controles apropriados do isotipo G de imunoglobulina espécie-específica. As células serão adquiridas usando um FACScan (Becton Dickinson) e analisadas com o software Cell Quest.

Para avaliar a colonização de bactérias intestinais, amostras fecais foram coletadas de cada paciente no dia 0 (o dia em que os pacientes foram incluídos), no dia 3 e no dia 7 após o tratamento com probióticos ou placebo. As amostras fecais foram pesadas, homogeneizadas e diluídas seriadamente e semeadas em ágar seletivo para análise de bactérias. A contagem de bactérias fecais foi expressa em log10 UFC/g de fezes.

Amostras fecais foram coletadas durante o período de tratamento. Os níveis de IgA foram realizados em amostras fecais homogeneizadas. A IgA total foi determinada usando o conjugado IgA-HRP anti-humano de cabra. A reação foi desenvolvida com tetrametil benzidina (TMB; Zymed Labs.) e lida a 450 nm. Os valores de DO foram convertidos em ng/g de fezes de IgA total por comparação com uma curva padrão desenvolvida com anti-IgA humana.

As amostras de fezes foram preparadas e analisadas para lactoferrina. Um anticorpo policlonal específico para lactoferrina foi pré-revestido em uma microplaca. A lactoferrina em padrões e amostras é ensanduichada pelo anticorpo imobilizado e um anticorpo policlonal biotinilado específico para lactoferrina, que é reconhecido por um conjugado de estreptavidina-peroxidase. A absorvância é lida a DO 450 nm. A lactoferrina foi expressa em μg/g de fezes.

As amostras de fezes foram preparadas e analisadas para calprotectina. O sobrenadante foi coletado e congelado a -20°C. Os sobrenadantes foram descongelados e a calprotectina foi analisada com o ELISA quantitativo de calprotectina e lida a OD 450 nm. A calprotectina foi expressa em μg/g de fezes.