Wpływ probiotyków na populację bakterii jelitowych i modulację odporności

Niektóre parametry kliniczne oceniano zgodnie z następującymi kryteriami: punkt końcowy pierwotny (nasilenie biegunki) i wynik drugorzędowy obejmujący zmianę masy ciała, apetyt i dzienne spożycie, wzdęcia lub wzdęcia brzucha, ból brzucha lub kolkę, zaparcia, gorączkę i wymioty. .

Krew obwodową wyizolowano za pomocą Lymphoprep, przemyto dwukrotnie normalną solą fizjologiczną i raz w pożywce i zawieszono w pożywce [RPMI 1640] do gęstości 1 x 106/ml. PBMC zostaną wyizolowane z leukocytów dawcy krwi przez wirowanie w gradiencie gęstości. Stężenie PBMC zostanie ustawione na 106 komórek na ml w kompletnej pożywce, a komórki zostaną przeniesione na 24-studzienkowe płytki. Ekspresja fenotypu na powierzchni komórek i barwienie wewnątrzkomórkowe. Komórki zostaną wybarwione przy użyciu zestawu przeciwciał monoklonalnych (MAb) skierowanych przeciwko antygenom powierzchniowym wyrażanym przez limfocyty, monocyty i odpowiednie kontrole swoistego gatunkowo immunoglobuliny G. Komórki zostaną pobrane za pomocą FACScan (Becton Dickinson) i przeanalizowane za pomocą oprogramowania Cell Quest.

Aby ocenić kolonizację bakterii jelitowych, próbki kału pobrano od każdego pacjenta w dniu 0 (dzień, w którym pacjenci zostali zapisani), w dniu 3 i dniu 7 po probiotykach lub leczeniu placebo. Próbki kału zważono, homogenizowano i seryjnie rozcieńczano i wysiano na selektywnym agarze w celu analizy bakterii. Liczbę bakterii w kale wyrażono jako log10 CFU/g kału.

Próbki kału pobierano w okresie leczenia. Poziomy IgA oznaczano na homogenizowanych próbkach kału. Całkowitą IgA określono stosując koniugat koziej anty-ludzkiej IgA-HRP. Reakcję wywołano tetrametylobenzydyną (TMB; Zymed Labs.) i odczytano przy 450 nm. Wartości OD przeliczono na ng/g kału całkowitej IgA przez porównanie z krzywą standardową opracowaną dla anty-ludzkiej IgA.

Próbki kału przygotowano i analizowano na obecność laktoferyny. Poliklonalne przeciwciało specyficzne dla laktoferyny zostało wstępnie powleczone na mikropłytce. Laktoferyna w standardach i próbkach jest umieszczona pomiędzy unieruchomionym przeciwciałem i biotynylowanym przeciwciałem poliklonalnym specyficznym dla laktoferyny, które jest rozpoznawane przez koniugat streptawidyna-peroksydaza. Absorbancję odczytuje się przy OD 450 nm. Laktoferynę wyrażano jako μg/g kału.

Próbki kału przygotowano i przeanalizowano pod kątem kalprotektyny. Supernatant zebrano i zamrożono w temperaturze -20°C. Supernatanty rozmrożono i kalprotektynę analizowano za pomocą ilościowego testu ELISA kalprotektyny i odczytywano przy OD 450 nm. Kalprotektynę wyrażono jako μg/g kału.