Влияние пробиотиков на популяцию кишечных бактерий и иммуномодуляцию

Некоторые клинические параметры оценивались в соответствии со следующим: первичный результат (тяжесть диареи) и вторичный результат, включая изменение массы тела, аппетит и суточное потребление, вздутие живота или вздутие живота, боль или колики в животе, запор, лихорадку и рвоту. .

Периферическую кровь, выделенную с помощью Lymphoprep, дважды промывали физиологическим раствором и один раз в среде и суспендировали в среде [RPMI 1640] до плотности 1 x 106/мл. РВМС выделяют из лейкоцитарных пленок доноров крови центрифугированием в градиенте плотности. Концентрацию РВМС доводят до 106 клеток на мл в полной среде, и клетки переносят в 24-луночные планшеты. Экспрессия фенотипа клеточной поверхности и внутриклеточное окрашивание. Клетки будут окрашивать с использованием панели моноклональных антител (MAb), направленных против поверхностных антигенов, экспрессируемых лимфоцитами, моноцитами и соответствующими видоспецифичными контролями изотипа иммуноглобулина G. Клетки будут получены с использованием FACScan (Becton Dickinson) и проанализированы с помощью программного обеспечения Cell Quest.

Для оценки колонизации кишечными бактериями образцы фекалий собирали у каждого пациента на 0-й день (день, когда пациенты были включены в исследование), на 3-й и 7-й день после лечения пробиотиками или плацебо. Образцы фекалий взвешивали, гомогенизировали, серийно разбавляли и высевали на селективный агар для анализа бактерий. Количество фекальных бактерий выражали как log10 КОЕ/г фекалий.

Образцы кала собирали в течение периода лечения. Уровни IgA определяли на гомогенизированных образцах фекалий. Общий IgA определяли с использованием конъюгата козьего античеловеческого IgA-HRP. Реакцию проявляли тетраметилбензидином (TMB; Zymed Labs.) и считывали при 450 нм. Значения OD были преобразованы в нг/г фекалий общего IgA путем сравнения со стандартной кривой, полученной с использованием античеловеческого IgA.

Образцы стула были приготовлены и проанализированы на лактоферрин. Поликлональное антитело, специфичное к лактоферрину, было предварительно нанесено на микропланшет. Лактоферрин в стандартах и ​​образцах состоит из иммобилизованного антитела и биотинилированного поликлонального антитела, специфичного к лактоферрину, которое распознается конъюгатом стрептавидин-пероксидаза. Поглощение считывают при OD 450 нм. Лактоферрин выражали в мкг/г фекалий.

Образцы стула были приготовлены и проанализированы на кальпротектин. Супернатант собирали и замораживали при -20°С. Супернатанты оттаивали и кальпротектин анализировали с помощью количественного ELISA кальпротектина и считывали при оптической плотности 450 нм. Кальпротектин выражали в мкг/г фекалий.