Změny počtu CEC pro podporu diagnostiky GvHD. (ALLOCEC)

Poškození endotelu je charakteristikou společnou pro několik komplikací vaskulárního původu, které se mohou vyskytnout v průběhu allo-HSCT (GVHD, IPS, VOD, TMA). Diagnostika vaskulárních komplikací představuje zajímavou výzvu, ale bohužel omezenou tím, že markerů poškození endotelu je extrémně vzácné. Zejména plazmatická dávka von Willebrandova faktoru, trombomodulinu a adhezivních molekul přinesla výsledky, které je obtížné použít pro potenciální aplikaci pro rutinní diagnostiku pro vysoký stupeň nespecifity a potenciální vliv na test komorbidními stavy souvisejícími s příjemce. Mnohem nadějnější se jeví metody, které jsou založeny na hodnocení mikročástic pocházejících z endotelových buněk (EMP) nebo přímém počítání cirkulujících endoteliálních buněk (CEC). Nedávno byly EMP hodnoceny průtokovou cytometrií (annexin V-FITC a anti-CD62-PE) u 19 pacientů podstupujících allo-HSCT, což ukazuje na nárůst pacientů s akutním stupněm GvHD ≥ I ve srovnání s pacienty, kteří nevykazovali GvHD. Navíc se nezdálo, že by hodnocení EMP bylo ovlivněno přípravným režimem radiochemoterapie. Tato metoda je však zatížena procedurální složitostí a určitou nespecifičností vzhledem k tomu, že mikročástice mohou být uvolňovány jak endoteliálními buňkami, tak iz krevních destiček, červených krvinek a leukocytů.

V současné době se přímé počítání CEC zdá být nejspolehlivějším způsobem hodnocení stupně poškození endotelu. Ukázalo se, že nález zvýšeného počtu CEC odráží rozsah endoteliálního poškození u řady patologií autoimunitní povahy, ale stále jde o předběžná data v průběhu allo-HSCT. Woywodt a kol. prokázali u pacientů s ANCA-pozitivní vaskulitidou korelaci mezi počtem CEC a stupněm aktivity onemocnění a odpovědí na léčbu. Navíc počet CEC u pacientů podstupujících transplantaci ledvin koreluje s rizikem odmítnutí orgánu. V průběhu allo-HSCT stejní autoři prokázali korelaci mezi počtem CEC a poškozením endotelu indukovaným přípravným režimem radiochemoterapie. Neexistence standardizované metody, použití manuálních postupů imunoselekce, nedostatek konsenzu o identifikaci CEC však představují limitující faktory pro rutinní aplikaci.

Tato studie má formu prospektivní studie. Primárním cílovým parametrem je identifikace a stanovení počtu CEC v periferní krvi pacientů s hematologickými poruchami podstupujícími allo-HSCT jako funkce poškození endotelu. Sekundárním cílem je definovat prognostickou a prediktivní hodnotu změn počtu CEC na diagnózu GvHD a na odpověď na léčbu.

Periferní krev (PB) bude odebrána před (T1, výchozí hodnota) a na konci přípravného režimu (T2, před transplantací), po potvrzení hematopoetické obnovy (T3, přihojení) a poté při nástupu GVHD (GVHD T4) a jeden týden po zahájení steroidní terapie (T5, po GvHD) pro kontrolu GvHD. Všichni pacienti budou také kontrolováni na CEC v den + 28.

Periferní krev pro počítání CEC bude odebírána do zkumavky CellSave Preservative Tube (Veridex, J & J, USA), obsahující konzervační látku pro stabilizaci buněk při pokojové teplotě, pro počítání pomocí systému CellSearch® a v CBC zkumavka obsahující K2EDTA pro počítání pomocí průtokové cytometrie.

Systémem CellSearch® bude událost klasifikována jako CEC, pokud její morfologie odpovídá morfologii buňky a současně vykazuje následující fenotyp: CD146+, CD105+, DAPI+ a CD45-. Postupem průtokové cytometrie bude po obarvení buněk lyofilizovanými protilátkami zkumavky Endo Panel (CD146, 7-AAD, CD34, CD309, CD45) okamžitě získáno 4x106 událostí v hradle lymfo-monocytů při průtokové cytometrii.