Modifiche al conteggio CEC per supportare la diagnosi GvHD. (ALLOCEC)

Il danno endoteliale è una caratteristica comune a diverse complicanze di origine vascolare che possono verificarsi in corso di allo-HSCT (GVHD, IPS, VOD, TMA). La diagnosi delle complicanze vascolari rappresenta una sfida interessante, ma purtroppo limitata dal fatto che i marcatori di danno endoteliale sono estremamente scarsi. In particolare, il dosaggio plasmatico del fattore di von Willebrand, della trombomodulina e delle molecole di adesione ha generato risultati difficilmente utilizzabili per una potenziale applicazione per la diagnostica di routine per l'elevato grado di aspecificità e la potenziale influenza sul dosaggio da parte di condizioni di comorbilità legate alla destinatario. Metodi molto più promettenti sembrano essere quelli che si basano sulla valutazione di microparticelle derivate da cellule endoteliali (EMP) o sul conteggio diretto delle cellule endoteliali circolanti (CEC). Recentemente, l'EMP è stato valutato mediante citometria a flusso (annexina V-FITC e anti-CD62-PE) in 19 pazienti sottoposti a allo-HSCT, mostrando un aumento nei pazienti con GvHD acuta di grado ≥ I, rispetto ai pazienti che non mostravano GvHD. Inoltre, la valutazione dell'EMP non sembrava essere influenzata dal regime di condizionamento radio-chemioterapico. Questo metodo è tuttavia gravato da una complessità procedurale e da un certo grado di aspecificità dovuta al fatto che le microparticelle possono essere rilasciate dalle cellule endoteliali oltre che anche dalle piastrine, dai globuli rossi e dai leucociti.

Attualmente, il conteggio diretto della CEC sembra essere il modo più affidabile per valutare il grado di danno endoteliale. Il riscontro di numeri elevati di CEC ha dimostrato di riflettere l'entità del danno endoteliale in numerose patologie di natura autoimmune, ma sono ancora dati preliminari in corso di allo-HSCT. Woywodt et al. dimostrato nei pazienti con vasculite ANCA-positiva una correlazione tra il numero di CEC e il grado di attività della malattia e la risposta al trattamento. Inoltre, il numero di CEC correla, nei pazienti sottoposti a trapianto renale, con il rischio di rigetto d'organo. In corso di allo-HSCT, gli stessi autori hanno mostrato una correlazione tra il numero di CEC e il danno endoteliale indotto dal regime di condizionamento radio-chemioterapico. Tuttavia, la mancanza di un metodo standardizzato, l'uso di procedure manuali di immunoselezione, la mancanza di consenso sull'identificazione di CEC rappresentano fattori limitanti per l'applicazione di routine.

Il presente studio assume la forma di uno studio prospettico. L'endpoint primario è l'identificazione e l'enumerazione delle CEC nel sangue periferico di pazienti con disturbi ematologici sottoposti a allo-HSCT, in funzione del danno endoteliale. L'endpoint secondario è definire il valore prognostico e predittivo dei cambiamenti dei conteggi CEC sulla diagnosi di GvHD e sulla risposta al trattamento.

Il sangue periferico (PB) verrà prelevato prima (T1, basale) e alla fine del regime di condizionamento (T2, pre-trapianto), alla conferma del recupero ematopoietico (T3, attecchimento) e successivamente all'insorgenza di GVHD (GVHD T4) e una settimana dopo l'inizio della terapia steroidea (T5, post-GvHD) per il controllo della GvHD. Tutti i pazienti saranno controllati anche per CEC al giorno + 28.

Il sangue periferico per il conteggio del CEC sarà raccolto, rispettivamente, nella CellSave Preservative Tube (Veridex, J & J, USA), contenente un conservante per la stabilizzazione delle cellule a temperatura ambiente, per il conteggio con il CellSearch® System e nell'emocromo provetta contenente K2EDTA, per il conteggio mediante citometria a flusso.

Dal sistema CellSearch® un evento sarà classificato come CEC quando la sua morfologia è coerente con quella di una cellula e mostra contemporaneamente il seguente fenotipo: CD146+, CD105+, DAPI+ e CD45-. Mediante la procedura di citometria a flusso, dopo la colorazione delle cellule con anticorpi liofilizzati della provetta Endo Panel (CD146, 7-AAD, CD34, CD309, CD45) 4x106 eventi nel gate dei linfomonociti saranno immediatamente acquisiti in citometria a flusso.