Изменения подсчета CEC для поддержки диагностики GvHD. (ALLOCEC)

Повреждение эндотелия характерно для ряда осложнений сосудистого генеза, которые могут возникать в ходе алло-ТГСК (РТПХ, IPS, VOD, TMA). Диагностика сосудистых осложнений представляет собой интересную задачу, но, к сожалению, она ограничена тем фактом, что маркеры повреждения эндотелия чрезвычайно скудны. В частности, плазменная доза фактора фон Виллебранда, тромбомодулина и молекул адгезии дала результаты, которые трудно использовать для потенциального применения в рутинной диагностике из-за высокой степени неспецифичности и потенциального влияния на анализ сопутствующих заболеваний, связанных с получатель. Гораздо более многообещающими являются те методы, которые основаны на оценке микрочастиц, полученных из эндотелиальных клеток (ЭМП), или прямом подсчете циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦИК). Недавно EMP оценивали с помощью проточной цитометрии (аннексин V-FITC и анти-CD62-PE) у 19 пациентов, перенесших алло-ТГСК, что показало увеличение числа пациентов с острой РТПХ степени ≥ I по сравнению с пациентами, у которых не было РТПХ. Кроме того, на оценку ЭМП, по-видимому, не влиял режим кондиционирования радиохимиотерапии. Однако этот метод обременен процедурной сложностью и определенной степенью неспецифичности из-за того, что микрочастицы могут высвобождаться эндотелиальными клетками, а также тромбоцитами, эритроцитами и лейкоцитами.

В настоящее время прямой подсчет ЦИК представляется наиболее надежным способом оценки степени повреждения эндотелия. Показано, что обнаружение повышенных показателей ЦИК отражает степень поражения эндотелия при многочисленных патологиях аутоиммунного характера, но все же является предварительными данными при проведении алло-ТГСК. Войводт и др. продемонстрировали у больных с ANCA-позитивным васкулитом корреляцию между количеством ЦИК и степенью активности заболевания и ответом на лечение. Более того, количество ЦИК коррелирует у пациентов, перенесших трансплантацию почки, с риском отторжения органа. В ходе аллоТГСК те же авторы показали корреляцию между количеством ЦИК и повреждением эндотелия, индуцированным радиохимиотерапевтическим режимом кондиционирования. Однако отсутствие стандартизированного метода, использование ручных процедур иммуноселекции, отсутствие консенсуса по идентификации ЦИК представляют собой ограничивающие факторы для рутинного применения.

Настоящее исследование выполнено в форме проспективного исследования. Первичной конечной точкой является идентификация и подсчет ЦИК в периферической крови пациентов с гематологическими нарушениями, перенесших алло-ТГСК, в зависимости от повреждения эндотелия. Вторичной конечной точкой является определение прогностической и прогностической ценности изменений количества ЦИК при диагностике РТПХ и ответе на лечение.

Периферическая кровь (PB) будет взята до (T1, исходный уровень) и в конце режима кондиционирования (T2, до трансплантации), после подтверждения восстановления кроветворения (T3, приживление) и после этого в начале РТПХ (GVHD T4) и через неделю после начала стероидной терапии (Т5, пост-РТПХ) для контроля РТПХ. Все пациенты также будут проверены на ЦИК на +28 день.

Периферическую кровь для подсчета ЦИК собирают соответственно в пробирку для консервации CellSave (Veridex, J & J, США), содержащую консервант для стабилизации клеток при комнатной температуре, для подсчета с помощью системы CellSearch® и в общий анализ крови. пробирка, содержащая K2EDTA, для подсчета с помощью проточной цитометрии.

В системе CellSearch® событие будет классифицировано как CEC, если его морфология соответствует морфологии клетки и одновременно демонстрирует следующий фенотип: CD146+, CD105+, DAPI+ и CD45-. По процедуре проточной цитометрии после окрашивания клеток лиофилизированными антителами из пробирки Endo Panel (CD146, 7-AAD, CD34, CD309, CD45) при проточной цитометрии сразу регистрируется 4x106 событий в воротах лимфо-моноцитов.