Zmiany liczby CEC w celu obsługi diagnostyki GvHD. (ALLOCEC)

Uszkodzenie śródbłonka jest cechą wspólną kilku powikłań pochodzenia naczyniowego, które mogą wystąpić w przebiegu allo-HSCT (GVHD, IPS, VOD, TMA). Rozpoznanie powikłań naczyniowych stanowi interesujące wyzwanie, niestety ograniczone przez fakt, że markery uszkodzenia śródbłonka są niezwykle rzadkie. W szczególności osoczowe dawkowanie czynnika von Willebranda, trombomoduliny i cząsteczek adhezyjnych dało wyniki trudne do wykorzystania w potencjalnej rutynowej diagnostyce ze względu na wysoki stopień nieswoistości i potencjalny wpływ na test współistniejących chorób związanych z odbiorca. Znacznie bardziej obiecujące wydają się metody oparte na ocenie mikrocząstek pochodzących z komórek śródbłonka (EMP) lub bezpośrednim zliczaniu krążących komórek śródbłonka (CEC). Ostatnio EMP oceniono za pomocą cytometrii przepływowej (aneksyna V-FITC i anty-CD62-PE) u 19 pacjentów poddawanych allo-HSCT, wykazując wzrost liczby pacjentów z ostrą GvHD stopnia ≥ I w porównaniu z pacjentami, którzy nie wykazywali GvHD. Ponadto wydaje się, że na ocenę EMP nie miał wpływu schemat kondycjonowania radiochemioterapii. Metoda ta jest jednak obarczona złożonością proceduralną i pewnym stopniem niespecyficzności ze względu na fakt, że mikrocząsteczki mogą być uwalniane zarówno przez komórki śródbłonka, jak i płytki krwi, krwinki czerwone i leukocyty.

Obecnie bezpośrednie liczenie CEC wydaje się być najbardziej wiarygodnym sposobem oceny stopnia uszkodzenia śródbłonka. Wykazano, że stwierdzenie podwyższonej liczby CEC odzwierciedla stopień uszkodzenia śródbłonka w licznych patologiach o charakterze autoimmunologicznym, ale nadal są to dane wstępne w przebiegu allo-HSCT. Woywodta i in. wykazali u pacjentów z ANCA-dodatnim zapaleniem naczyń korelację między liczbą CEC a stopniem aktywności choroby i odpowiedzią na leczenie. Ponadto liczba CEC koreluje u pacjentów poddawanych transplantacji nerki z ryzykiem odrzucenia narządu. W przebiegu allo-HSCT ci sami autorzy wykazali korelację między liczbą CEC a uszkodzeniem śródbłonka wywołanym kondycjonującym schematem radiochemioterapii. Jednak brak wystandaryzowanej metody, stosowanie manualnych procedur immunoselekcji, brak konsensusu co do identyfikacji CEC stanowią czynniki ograniczające rutynowe stosowanie.

Niniejsze badanie ma formę badania prospektywnego. Pierwszorzędowym punktem końcowym jest identyfikacja i oznaczenie liczby CEC we krwi obwodowej pacjentów z zaburzeniami hematologicznymi poddawanych allo-HSCT, w funkcji uszkodzenia śródbłonka. Drugorzędowym punktem końcowym jest określenie prognostycznej i predykcyjnej wartości zmian liczby CEC w rozpoznaniu GvHD i odpowiedzi na leczenie.

Krew obwodowa (PB) zostanie pobrana przed (T1, linia podstawowa) i na końcu schematu kondycjonowania (T2, przed przeszczepem), po potwierdzeniu regeneracji hematopoetycznej (T3, wszczepienie), a następnie na początku GVHD (GVHD T4) i tydzień po rozpoczęciu terapii steroidowej (T5, po GvHD) w celu kontroli GvHD. Wszyscy pacjenci zostaną również zbadani pod kątem CEC w dniu +28.

Krew obwodowa do zliczania CEC zostanie pobrana odpowiednio do probówki CellSave Preservative Tube (Veridex, J & J, USA), zawierającej środek konserwujący do stabilizacji komórek w temperaturze pokojowej, do zliczania za pomocą systemu CellSearch® i do CBC probówka zawierająca K2EDTA, do zliczania metodą cytometrii przepływowej.

W systemie CellSearch® zdarzenie zostanie sklasyfikowane jako CEC, jeśli jego morfologia jest zgodna z komórką i jednocześnie wykazuje następujący fenotyp: CD146+, CD105+, DAPI+ i CD45-. W procedurze cytometrii przepływowej, po wybarwieniu komórek liofilizowanymi przeciwciałami probówki Endo Panel (CD146, 7-AAD, CD34, CD309, CD45) w cytometrii przepływowej zostanie natychmiast zarejestrowanych 4x106 zdarzeń w bramce limfo-monocytów.