Zárodečné mutace u adenokarcinomu pankreatu (PaMPA)

Pozadí duktální adenokarcinom slinivky břišní má špatnou prognózu, což je zvýrazněno především nízkou pětiletou mírou přežití, která se odhaduje na přibližně 6 %. Ačkoli výskyt rakoviny slinivky je přibližně 0,5 % v běžné populaci, má vysokou mortalitu. Ve Spojených státech je registrována jako čtvrtá hlavní příčina úmrtí souvisejících s rakovinou. Špatná prognóza je způsobena především nedostatkem účinných možností léčby.

Vzhledem k tomu, že většina případů adenokarcinomu pankreatu je sporadická, familiární shlukování (definované přítomností alespoň dvou příbuzných prvního stupně s rakovinou pankreatu) je pozorováno u ~ 20 % případů, zatímco jasná genetická příčina je identifikována přibližně u poloviny z nich. případy. Je známo, že rakovina pankreatu se vyskytuje u řady predisponujících syndromů, jako je dědičná rakovina prsu a vaječníků, Peutz-Jeghersova, familiární adenomatózní polypóza, Lynch, Li-Fraumeni a familiární atypické mnohočetné molární syndromy, i když existují jasné souvislosti se ztrátou -of-funkční mutace v genech nesyndromové rakoviny, jako jsou PALB2 a ATM. Kromě toho jsou jedinci nesoucí mutace v genu PRSS1, který predisponuje k dědičné pankreatitidě, také považováni za vysoce rizikové pro rakovinu slinivky břišní. Je tedy zřejmé, že rakovina slinivky břišní nesouvisí s jediným genem pro predispozici k rakovině, ale s mnoha známými a pravděpodobně dosud neobjevenými geny náchylnosti k rakovině.

Na druhou stranu přesný podíl genetické predispozice u rakoviny slinivky nebyl stanoven. Předchozí studie hodnotily prevalenci ztrát funkce mutací ve známých genech predispozice k rakovině u pacientů s rakovinou pankreatu pomocí multigenových panelů. Výtěžnost mutací se pohybovala od 3,8 % do 9,7 % v genech, které byly dříve shledány relevantními pro predispozici rakoviny slinivky břišní.

Prostřednictvím těchto studií bylo zdůrazněno, že rodinná anamnéza a stadium rakoviny pankreatu nebo věk v době diagnózy nejsou vždy prediktorem základního genetického faktoru, zatímco fenotypová heterogenita je obvykle spojena se stavem mutace. Hledání nových predispozičních genů u pacientů s rakovinou pankreatu bez rodinné anamnézy probíhá prostřednictvím analýzy kandidátních genů nebo prostřednictvím sekvenování celého exomu.

Metodika výzkumu Klinickopatologická charakteristika

Genomová DNA od pacientů s rakovinou pankreatu bude v letech 2000-2019 retrospektivně a prospektivně sbírána z úložiště nádorů Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG). Od všech pacientů již byl získán písemný informovaný souhlas s použitím a uchováváním jejich biologického materiálu spolu s jejich souhlasem s jejich účastí ve výzkumných studiích. Studie bude v souladu s Helsinským prohlášením z roku 1975, revidovaným v roce 1983.

Klinickopatologické charakteristiky pacientů s karcinomem pankreatu budou získány z jejich lékařské dokumentace. Diagnóza bude potvrzena prostřednictvím patologických zpráv, které také poskytnou informace o stupni, rychlosti proliferace, histologickém podtypu a lymfovaskulární invazi. Z lékařského záznamu pacienta bude hlášena velikost nádoru, postižení uzlin a také metastatické léze (TNM staging). Důležité je, že bude shromažďována podrobná rodinná historie. Sběr těchto informací bude probíhat v souladu s předpisy bioetických komisí zúčastněných nemocnic. Klinickopatologické charakteristiky budou korelovány s různými genomickými abnormalitami identifikovanými sekvenováním.

Extrakce zárodečné DNA

Pacientům s rakovinou slinivky budou odebrány vzorky krve. Zárodečná DNA z bílých krvinek bude izolována pomocí komerčně dostupné soupravy pro extrakci krevní DNA. DNA zárodečné linie bude poté podrobena mechanické fragmentaci pomocí sonikace, aby se dosáhlo velikosti DNA přibližně 200-250 bp pro následnou analýzu sekvenování nové generace (NGS).

Sekvenování nové generace

Cílené zachycení obohacení NGS spoléhá na hybridizaci knihoven DNA v roztoku s TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) pro identifikaci zárodečných mutací u pacientů s rakovinou. Nejprve jsou navrženy a připraveny TACS, které se zaměřují na mutace spojené s dědičným zhoubným nádorem (v celkem 62 genech predisponujících k zhoubnému nádoru), a připravují se pomocí PCR s následnou biotinylací. Biotinylovaný TACS bude poté imobilizován na magnetických kuličkách potažených streptavidinem pro následnou hybridizaci s knihovnami DNA. Knihovny DNA se připravují ze zárodečné DNA pacienta, která splňuje kritéria kontroly kvality (výtěžek DNA, integrita DNA a velikost fragmentu) podle zavedených protokolů. Příprava knihovny zahrnuje ligaci 3' konce a 5' konce adaptéru a každá DNA knihovna bude označena čárovým kódem s použitím jedinečných oligonukleotidových DNA sekvencí, aby se umožnilo následné rozlišení po sekvenování. Po čárovém kódování budou vzorky podrobeny hybridizaci za použití na zakázku vyrobeného 5'-biotynylovaného TACS s následnou PCR amplifikací. Nakonec budou obohacené knihovny DNA normalizovány a sloučeny na platformě NGS před sekvenováním párových konců pomocí protokolů výrobce.

Bioinformatická a datová analýza Sekvenční data z leukocytů (buffy coat) DNA budou demultiplexována a zarovnána s lidským genomem (hg19) pomocí vhodných zarovnávacích algoritmů (BWA) pro vytvoření souboru BAM. K volání zárodečných mutací bude použita kombinace variantních volacích algoritmů. Bude provedeno lokální přerovnání pro přesnou detekci malých inzercí a delecí a vhodné algoritmy pro detekci přeuspořádání. Bioinformatické nástroje pro volání změn počtu kopií (CNAs), jako je ASCAT-2, CNVkit nebo ANACONDA, budou použity pro hodnocení fokálních genových amplifikací nebo delecí. Analýza založená na hloubce čtení bude také vzata v úvahu při hodnocení CNA na genové úrovni. K anotaci identifikovaných změn každého genu budou použity vhodné variantní anotátory. Pro klasifikaci variant podle směrnic ACMG budou použity databáze zárodečných variant, jako je ClinVar.