Mutacje germinalne w gruczolakoraku trzustki (PaMPA)

Wprowadzenie Gruczolakorak przewodowy trzustki ma złe rokowanie, na co wskazuje głównie niski wskaźnik przeżycia 5-letniego, który szacuje się na około 6%. Chociaż częstość występowania raka trzustki w populacji ogólnej wynosi około 0,5%, charakteryzuje się on wysoką śmiertelnością. Jest on rejestrowany jako czwarta najczęstsza przyczyna zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Złe rokowanie wynika głównie z braku skutecznych opcji leczenia.

Ponieważ większość przypadków gruczolakoraka trzustki jest sporadyczna, w około 20% przypadków obserwuje się skupienia rodzinne (określane przez obecność co najmniej dwóch krewnych pierwszego stopnia z rakiem trzustki), podczas gdy wyraźna przyczyna genetyczna jest identyfikowana w około połowie z tych przypadków sprawy. Wiadomo, że rak trzustki występuje w szeregu zespołów predysponujących do raka, takich jak dziedziczny rak piersi i jajnika, Peutz-Jeghers, rodzinna polipowatość gruczolakowata, Lynch, Li-Fraumeni i rodzinne atypowe zespoły mnogich znamion, podczas gdy istnieją wyraźne powiązania z utratą mutacje funkcji w niesyndromicznych genach raka, takich jak PALB2 i ATM. Ponadto uważa się, że osoby będące nosicielami mutacji w genie PRSS1, które predysponują do dziedzicznego zapalenia trzustki, znajdują się w grupie wysokiego ryzyka raka trzustki. Jest zatem jasne, że rak trzustki nie jest powiązany z pojedynczym genem predysponującym do raka, ale z wieloma znanymi i prawdopodobnie jeszcze nieodkrytymi genami podatności na raka.

Z drugiej strony, dokładny odsetek predyspozycji genetycznych w raku trzustki nie został określony. Wcześniejsze badania oceniały częstość występowania mutacji powodujących utratę funkcji w znanych genach predysponujących do raka u pacjentów z rakiem trzustki za pomocą paneli wielogenowych. Wydajność mutacji wahała się od 3,8% do 9,7% w genach, które wcześniej uznano za istotne dla predyspozycji do raka trzustki.

Dzięki tym badaniom podkreślono, że wywiad rodzinny i stopień zaawansowania raka trzustki lub wiek w momencie rozpoznania nie zawsze są predyktorami podstawowego czynnika genetycznego, podczas gdy heterogeniczność fenotypowa jest zwykle związana ze statusem mutacji. Trwają poszukiwania nowych genów predysponujących u pacjentów z rakiem trzustki bez wywiadu rodzinnego poprzez analizę genów kandydujących lub sekwencjonowanie całego egzomu.

Metodologia badań Charakterystyka kliniczno-patologiczna

Genomowy DNA od pacjentów z rakiem trzustki będzie retrospektywnie i prospektywnie zbierany z Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Gum Repository w latach 2000-2019. Od wszystkich pacjentów uzyskano już pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie i przechowywanie ich materiału biologicznego wraz ze zgodą na udział w badaniach naukowych. Badanie będzie zgodne z oświadczeniem z Helsinek z 1975 r., poprawionym w 1983 r.

Charakterystyka kliniczno-patologiczna pacjentów z rakiem trzustki zostanie pobrana z ich dokumentacji medycznej. Diagnoza zostanie potwierdzona raportami patologicznymi, które dostarczą również informacji o stopniu złośliwości, szybkości proliferacji, podtypie histologicznym i inwazji naczyń limfatycznych. Z dokumentacji medycznej pacjenta zostanie zgłoszona wielkość guza, zajęcie węzłów chłonnych oraz zmiany przerzutowe (stopień zaawansowania TNM). Co ważne, zostanie zebrany szczegółowy wywiad rodzinny. Gromadzenie tych informacji będzie zgodne z regulaminem komisji bioetycznych uczestniczących szpitali. Charakterystyka kliniczno-patologiczna będzie skorelowana z różnymi nieprawidłowościami genomowymi zidentyfikowanymi przez sekwencjonowanie.

Ekstrakcja DNA linii germinalnej

Próbki krwi będą pobierane od pacjentów z rakiem trzustki. DNA linii zarodkowej z białych krwinek zostanie wyizolowane przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji DNA krwi. DNA linii zarodkowej zostanie następnie poddane mechanicznej fragmentacji poprzez sonikację, aby osiągnąć rozmiar DNA około 200-250 bp do dalszej analizy sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Sekwencjonowanie nowej generacji

Ukierunkowane wzbogacanie wychwytu NGS opiera się na hybrydyzacji w roztworze bibliotek DNA z TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) w celu identyfikacji mutacji linii zarodkowej u pacjentów z rakiem. Po pierwsze, TACS, które celują w mutacje związane z dziedzicznym rakiem (w sumie 62 genów predysponujących do raka) są projektowane i przygotowywane przez PCR, a następnie biotynylację. Biotynylowane TACS zostaną następnie unieruchomione na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną w celu późniejszej hybrydyzacji z bibliotekami DNA. Biblioteki DNA są przygotowywane z DNA pochodzącego z linii zarodkowej pacjenta, które spełnia kryteria kontroli jakości (wydajność DNA, integralność DNA i wielkość fragmentów) zgodnie z ustalonymi protokołami. Przygotowanie biblioteki obejmuje ligację adaptera końca 3' i końca 5', a każda biblioteka DNA zostanie oznaczona kodem kreskowym przy użyciu unikalnych sekwencji oligonukleotydów DNA, aby umożliwić późniejsze rozróżnienie po sekwencjonowaniu. Po oznaczeniu kodem kreskowym próbki zostaną poddane hybrydyzacji przy użyciu wykonanego na zamówienie 5'-biotynylowanego TACS, a następnie amplifikacji PCR. Wreszcie, wzbogacone biblioteki DNA zostaną znormalizowane i zebrane na platformie NGS przed sekwencjonowaniem sparowanych końców przy użyciu protokołów producenta.

Bioinformatyka i analiza danych Dane dotyczące sekwencji DNA leukocytów (kożuszka leukocytarnego) będą demultipleksowane i dopasowywane do ludzkiego genomu (hg19) przy użyciu odpowiednich algorytmów aligner (BWA) w celu wygenerowania pliku BAM. Kombinacja algorytmów wywołujących warianty zostanie wykorzystana do wywołania mutacji linii płciowej. Lokalne wyrównanie zostanie przeprowadzone w celu dokładnego wykrycia małych insercji i delecji oraz odpowiednich algorytmów do wykrywania przegrupowań. Narzędzia bioinformatyczne do wywoływania zmian liczby kopii (CNA), takie jak ASCAT-2, CNVkit lub ANACONDA, zostaną wykorzystane do oceny zdarzeń ogniskowej amplifikacji lub delecji genów. Przeczytaj analizę opartą na głębokości, która zostanie również wzięta pod uwagę przy ocenie CNA na poziomie genów. Odpowiednie adnotatory wariantów zostaną użyte do przypisania zidentyfikowanych zmian do każdego genu. Bazy danych wariantów germinalnych, takie jak ClinVar, będą wykorzystywane do klasyfikacji wariantów zgodnie z wytycznymi ACMG.