Sukuradan mutaatiot haiman adenokarsinoomassa (PaMPA)

Tausta Haiman duktaalisen adenokarsinooman ennuste on huono, mikä johtuu pääasiassa alhaisesta 5 vuoden eloonjäämisasteesta, jonka arvioidaan olevan noin 6 %. Vaikka haimasyövän ilmaantuvuus on noin 0,5 % väestöstä, sen kuolleisuus on korkea. Se on rekisteröity neljänneksi yleisimmäksi syöpäkuolemien syyksi Yhdysvalloissa. Huono ennuste johtuu pääasiassa tehokkaiden hoitovaihtoehtojen puutteesta.

Suurin osa haiman adenokarsinoomatapauksista on satunnaisia, joten perheklusterit (määritelty vähintään kahden haimasyöpää sairastavan ensimmäisen asteen sukulaisen läsnäolosta) havaitaan noin 20 %:ssa tapauksista, kun taas noin puolella näistä tapauksista havaitaan selvä geneettinen syy. tapauksia. Haimasyövän tiedetään esiintyvän useissa syöpää altistavissa oireyhtymissä, kuten perinnöllinen rinta- ja munasarjasyöpä, Peutz-Jeghers, familiaalinen adenomatoottinen polypoos, Lynch, Li-Fraumeni ja familiaalinen epätyypillinen monimoolioireyhtymä, kun taas on ollut selvää yhteyttä menetykseen. funktionaaliset mutaatiot ei-syndromistisissa syöpägeeneissä, kuten PALB2 ja ATM. Lisäksi yksilöiden, joilla on mutaatioita PRSS1-geenissä, joka altistaa perinnölliselle haimatulehdukselle, katsotaan myös olevan korkea riski saada haimasyöpä. Siksi on selvää, että haimasyöpä ei liity yhteen syöpäalttiusgeeniin, vaan useisiin tunnettuihin ja luultavasti vielä löytämättömiin syöpäalttiusgeeneihin.

Toisaalta haimasyövän geneettisen alttiuden tarkkaa osaa ei ole määritetty. Aiemmissa tutkimuksissa on arvioitu haimasyöpäpotilaiden tunnetuissa syöpäalttiusgeeneissä esiintyvien toiminnan menettämisen mutaatioiden esiintyvyyttä monigeenipaneeleilla. Mutaatiosaanto vaihteli 3,8 %:sta 9,7 %:iin geeneissä, joiden aiemmin todettiin liittyvän haimasyöpäalttiuteen.

Näillä tutkimuksilla on korostettu, että suvussa esiintynyt haimasyövän vaihe tai ikä diagnoosissa ei aina ole taustalla olevan geneettisen tekijän ennustaja, kun taas fenotyyppinen heterogeenisyys liittyy yleensä mutaatiostatukseen. Uusien taipumusgeenien etsintä haimasyöpäpotilailla, joilla ei ole sukuhistoriaa, on meneillään ehdokasgeenianalyysin tai kokonaisen eksoomisekvensoinnin avulla.

Tutkimusmetodologia Kliiniset patologiset ominaisuudet

Haimasyöpäpotilaiden genominen DNA kerätään takautuvasti ja prospektiivisesti Hellenic Cooperative Oncology Groupin (HeCOG) tuumorivarastosta vuosien 2000–2019 aikana. Kaikilta potilailta on jo saatu kirjallinen tietoinen suostumus heidän biologisen materiaalinsa käyttöön ja varastointiin sekä heidän suostumuksensa osallistua tutkimuksiin. Tutkimus on yhdenmukainen vuonna 1983 tarkistetun vuoden 1975 Helsingin lausunnon kanssa.

Haimasyöpää sairastavien potilaiden kliiniset ominaisuudet haetaan heidän sairauskertomuksestaan. Diagnoosi vahvistetaan patologiaraporttien avulla, jotka tarjoavat myös tietoa asteesta, proliferaationopeudesta, histologisesta alatyypistä ja lymfosuonten invaasiosta. Potilaan sairauskertomuksesta raportoidaan kasvaimen koko, solmukohta sekä metastaattiset leesiot (TNM-vaiheistus). Tärkeää on, että yksityiskohtainen sukuhistoria kerätään. Näiden tietojen keräämisessä noudatetaan osallistuvien sairaaloiden bioetiikkatoimikuntien määräyksiä. Kliiniset patologiset ominaisuudet korreloivat sekvensoinnilla tunnistettujen erilaisten genomisten poikkeavuuksien kanssa.

Sukulinjan DNA:n erottaminen

Haimasyöpäpotilailta otetaan verinäytteitä. Sukulinjan DNA valkoisista verisoluista eristetään käyttämällä kaupallisesti saatavaa veren DNA:n erotuspakkausta. Sukulinjan DNA:lle suoritetaan sitten mekaaninen fragmentointi sonikaatiolla, jotta DNA:n koko saavutetaan noin 200-250 bp seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä (NGS) varten.

Seuraavan sukupolven sekvensointi

Kohdennettu sieppauksen rikastaminen NGS luottaa DNA-kirjastojen liuoksen hybridisaatioon TACS:n (Targeted Capture Enrichment Sequences) kanssa ituradan mutaatioiden tunnistamiseksi syöpäpotilailla. Ensinnäkin TACS:t, jotka kohdistuvat perinnölliseen syöpään liittyviin mutaatioihin (yhteensä 62 syöpää altistavassa geenissä), suunnitellaan ja valmistetaan PCR:llä, jota seuraa biotinylaatio. Biotinyloitu TACS immobilisoidaan sitten streptavidiinilla päällystettyihin magneettihelmiin myöhempää hybridisaatiota varten DNA-kirjastojen kanssa. DNA-kirjastot valmistetaan potilaasta peräisin olevasta ituradan DNA:sta, joka täyttää laadunvalvontakriteerit (DNA:n saanto, DNA:n eheys ja fragmentin koko) vakiintuneiden protokollien mukaisesti. Kirjaston valmisteluun kuuluu 3'-pään ja 5'-pään adapteriligaatio, ja jokainen DNA-kirjasto viivakoodataan käyttämällä ainutlaatuisia oligonukleotidi-DNA-sekvenssejä myöhemmän erottelun mahdollistamiseksi sekvensoinnin jälkeen. Viivakoodauksen jälkeen näytteet hybridisoidaan käyttämällä mittatilaustyönä valmistettua 5'-biotynyloitua TACS:ia, mitä seuraa PCR-monistaminen. Lopuksi rikastetut DNA-kirjastot normalisoidaan ja yhdistetään NGS-alustalla ennen paripään sekvensointia käyttämällä valmistajan protokollia.

Bioinformaattinen ja data-analyysi Sekvenssitiedot leukosyyttien (buffy coat) DNA:sta demultipleksoidaan ja kohdistetaan ihmisen genomiin (hg19) käyttämällä asianmukaisia ​​kohdistamisalgoritmeja (BWA) BAM-tiedoston luomiseksi. Varianttien kutsualgoritmien yhdistelmää käytetään kutsumaan ituradan mutaatioita. Paikallinen uudelleenkohdistus suoritetaan pienten lisäysten ja poistojen tarkkaa havaitsemista varten ja sopivat algoritmit uudelleenjärjestelyjen havaitsemiseksi. Fokaalisten geenien monistumisen tai deleetiotapahtumien arvioinnissa käytetään bioinformatiikan työkaluja kopionumeromuutoksien (CNA) kutsumiseen, kuten ASCAT-2, CNVkit tai ANACONDA. Myös lukusyvyysanalyysi otetaan huomioon geenitason CNA:iden arvioinnissa. Kunkin geenin tunnistettujen muutosten merkitsemiseen käytetään asianmukaisia ​​varianttiannotaattoreita. Sukulinjan varianttitietokantoja, kuten ClinVar, käytetään muunnelmien luokitteluun ACMG:n ohjeiden mukaisesti.