Keimbahnmutationen beim Pankreas-Adenokarzinom (PaMPA)

Hintergrund Das duktale Adenokarzinom des Pankreas hat eine schlechte Prognose, was vor allem durch die niedrige 5-Jahres-Überlebensrate deutlich wird, die auf etwa 6 % geschätzt wird. Obwohl die Inzidenz von Bauchspeicheldrüsenkrebs in der Allgemeinbevölkerung etwa 0,5 % beträgt, weist er eine hohe Sterblichkeitsrate auf. Es wird als vierthäufigste krebsbedingte Todesursache in den Vereinigten Staaten registriert. Die schlechte Prognose wird hauptsächlich auf das Fehlen effizienter Behandlungsmöglichkeiten zurückgeführt.

Da die Mehrzahl der Fälle von Pankreas-Adenokarzinom sporadisch auftritt, wird in ~20 % der Fälle eine familiäre Häufung (definiert durch das Vorhandensein von mindestens zwei Verwandten ersten Grades mit Bauchspeicheldrüsenkrebs) beobachtet, wobei in etwa der Hälfte dieser Fälle eine eindeutige genetische Ursache identifiziert wird Fälle. Es ist bekannt, dass Bauchspeicheldrüsenkrebs bei einer Reihe von krebsprädisponierenden Syndromen auftritt, wie z. B. erblicher Brust- und Eierstockkrebs, Peutz-Jeghers, familiäre adenomatöse Polyposis, Lynch, Li-Fraumeni und familiäres atypisches multiples Muttermalsyndrom, während es klare Assoziationen mit Verlust gibt -of-function-Mutationen in nicht-syndromalen Krebsgenen wie PALB2 und ATM. Darüber hinaus gelten Personen, die Mutationen im PRSS1-Gen tragen, das für eine hereditäre Pankreatitis prädisponiert, als besonders gefährdet für Bauchspeicheldrüsenkrebs. Es ist daher klar, dass Bauchspeicheldrüsenkrebs nicht mit einem einzelnen Krebsprädispositionsgen, sondern mit zahlreichen bekannten und wahrscheinlich noch zu entdeckenden Krebsanfälligkeitsgenen zusammenhängt.

Andererseits wurde der genaue Anteil der genetischen Veranlagung bei Bauchspeicheldrüsenkrebs nicht bestimmt. Frühere Studien haben die Prävalenz von Loss-of-Function-Mutationen in bekannten Krebsprädispositionsgenen bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs durch die Verwendung von Multi-Gen-Panels bewertet. Die Mutationsausbeute reichte von 3,8 % bis 9,7 % in Genen, die zuvor als relevant für die Prädisposition für Bauchspeicheldrüsenkrebs befunden wurden.

Durch diese Studien wurde hervorgehoben, dass die Familienanamnese und das Stadium des Bauchspeicheldrüsenkrebses oder das Alter bei der Diagnose nicht immer ein Prädiktor für einen zugrunde liegenden genetischen Faktor sind, während die phänotypische Heterogenität normalerweise mit dem Mutationsstatus verbunden ist. Die Suche nach neuen Prädispositionsgenen bei Bauchspeicheldrüsenkrebspatienten ohne Familienanamnese wird durch die Analyse von Kandidatengenen oder durch vollständige Exomsequenzierung fortgesetzt.

Forschungsmethodik Klinisch-pathologische Merkmale

Genomische DNA von Bauchspeicheldrüsenkrebspatienten wird in den Jahren 2000-2019 retrospektiv und prospektiv aus dem Tumorrepositorium der Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) gesammelt. Von allen Patienten wurde bereits eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung und Aufbewahrung ihres biologischen Materials zusammen mit ihrer Zustimmung zur Teilnahme an Forschungsstudien eingeholt. Die Studie wird mit der 1983 überarbeiteten Erklärung von Helsinki von 1975 übereinstimmen.

Klinisch-pathologische Merkmale von Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs werden aus ihrer Krankenakte abgerufen. Die Diagnose wird durch pathologische Berichte bestätigt, die auch Informationen über den Grad, die Proliferationsrate, den histologischen Subtyp und die lymphovaskuläre Invasion enthalten. Aus der Krankenakte des Patienten werden Tumorgröße, Lymphknotenbefall sowie Metastasen (TNM-Staging) berichtet. Wichtig ist, dass eine detaillierte Familienanamnese erhoben wird. Die Erfassung dieser Informationen erfolgt in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Bioethik-Kommissionen der teilnehmenden Krankenhäuser. Klinisch-pathologische Merkmale werden mit den verschiedenen genomischen Anomalien korreliert, die durch Sequenzierung identifiziert wurden.

Keimbahn-DNA-Extraktion

Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs werden Blutproben entnommen. Keimbahn-DNA aus weißen Blutkörperchen wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Blut-DNA-Extraktionskits isoliert. Die Keimbahn-DNA wird dann einer mechanischen Fragmentierung durch Beschallung unterzogen, um eine DNA-Größe von etwa 200–250 bp für die nachgelagerte Next-Generation-Sequenzierungsanalyse (NGS) zu erreichen.

Sequenzierung der nächsten Generation

Targeted Capture Enrichment NGS beruht auf der In-Lösung-Hybridisierung von DNA-Bibliotheken mit TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) zur Identifizierung von Keimbahnmutationen bei Krebspatienten. Zunächst werden TACS, die auf Mutationen abzielen, die mit erblichem Krebs assoziiert sind (insgesamt 62 krebsprädisponierende Gene), entworfen und durch PCR mit anschließender Biotinylierung hergestellt. Biotinyliertes TACS wird dann für die anschließende Hybridisierung mit den DNA-Bibliotheken auf Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen immobilisiert. DNA-Bibliotheken werden aus von Patienten stammender Keimbahn-DNA erstellt, die Qualitätskontrollkriterien (DNA-Ausbeute, DNA-Integrität und Fragmentgröße) gemäß etablierten Protokollen erfüllen. Die Bibliotheksvorbereitung umfasst die 3'-Ende- und 5'-Ende-Adapter-Ligation, und jede DNA-Bibliothek wird unter Verwendung einzigartiger Oligonukleotid-DNA-Sequenzen barcodiert, um eine nachfolgende Unterscheidung nach der Sequenzierung zu ermöglichen. Nach dem Barcoding werden die Proben einer Hybridisierung unter Verwendung von maßgeschneidertem 5'-biotynyliertem TACS gefolgt von einer PCR-Amplifikation unterzogen. Schließlich werden angereicherte DNA-Bibliotheken normalisiert und auf einer NGS-Plattform gepoolt, bevor die Paired-End-Sequenzierung unter Verwendung der Protokolle des Herstellers durchgeführt wird.

Bioinformatik und Datenanalyse Sequenzdaten von Leukozyten-(Buffy-Coat)-DNA werden demultiplexiert und mit geeigneten Aligner-Algorithmen (BWA) mit dem menschlichen Genom (hg19) abgeglichen, um eine BAM-Datei zu erzeugen. Eine Kombination von Varianten-Calling-Algorithmen wird verwendet, um Keimbahnmutationen zu callen. Eine lokale Neuausrichtung wird durchgeführt, um kleine Insertionen und Deletionen genau zu erkennen, und geeignete Algorithmen zur Erkennung von Neuanordnungen. Bioinformatik-Tools für Kopienzahländerungen (CNAs) wie ASCAT-2, CNVkit oder ANACONDA werden für die Bewertung von fokalen Genamplifikations- oder -deletionsereignissen verwendet. Eine auf der Lesetiefe basierende Analyse wird auch für die Bewertung von CNAs auf Genebene berücksichtigt. Geeignete Varianten-Annotatoren werden verwendet, um die identifizierten Veränderungen an jedem Gen zu kommentieren. Keimbahn-Variantendatenbanken wie ClinVar werden für die Klassifizierung von Varianten gemäß den ACMG-Richtlinien verwendet.