Kimlinjemutasjoner i bukspyttkjerteladenokarsinom (PaMPA)

Bakgrunn Pankreatisk duktalt adenokarsinom har dårlig prognose hovedsakelig fremhevet av den lave 5-års overlevelsesraten, som anslås å være rundt 6 %. Selv om forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen er omtrent 0,5 % i den generelle befolkningen, har den en høy dødelighet. Det blir registrert som den fjerde ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall i USA. Dårlig prognose skyldes hovedsakelig mangelen på effektive behandlingsalternativer.

Med de fleste tilfeller av bukspyttkjerteladenokarsinom som sporadiske, observeres familiær clustering (definert ved tilstedeværelsen av minst to førstegradsslektninger med bukspyttkjertelkreft) i ~20 % av tilfellene, mens en klar genetisk årsak er identifisert i omtrent halvparten av disse. saker. Bukspyttkjertelkreft er kjent for å forekomme i en rekke kreftpredisponerende syndromer, som arvelig bryst- og eggstokkreft, Peutz-Jeghers, familiær adenomatøs polypose, Lynch, Li-Fraumeni og familiære atypiske multippel føflekk-syndromer, mens det har vært klare assosiasjoner til tap -of-function mutasjoner i ikke-syndromiske kreftgener, slik som PALB2 og ATM. I tillegg anses individer som bærer mutasjoner i PRSS1-genet som disponerer for arvelig pankreatitt også å ha høy risiko for kreft i bukspyttkjertelen. Det er derfor klart at kreft i bukspyttkjertelen ikke er relatert til et enkelt kreftpredisposisjonsgen, men med en rekke kjente og sannsynligvis ennå ikke oppdaget kreftfølsomhetsgener.

På den annen side er den nøyaktige andelen av genetisk disposisjon i bukspyttkjertelkreft ikke bestemt. Tidligere studier har evaluert forekomsten av mutasjoner med tap av funksjon i kjente kreftpredisposisjonsgener hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen gjennom bruk av multigenpaneler. Mutasjonsutbyttet varierte fra 3,8 % til 9,7 % i gener som tidligere ble funnet relevante for predisposisjon for bukspyttkjertelkreft.

Gjennom disse studiene har det blitt fremhevet at familiehistorie og stadium av kreft i bukspyttkjertelen eller alder ved diagnose ikke alltid er en prediktor for en underliggende genetisk faktor, mens fenotypisk heterogenitet vanligvis er assosiert med mutasjonsstatus. Jakten etter nye predisposisjonsgener hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen uten familiehistorie pågår gjennom kandidatgenanalyse eller gjennom hele eksomsekvensering.

Forskningsmetodikk Klinisk patologiske egenskaper

Genomisk DNA fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen vil bli innsamlet retrospektivt og prospektivt fra Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repository, gjennom årene 2000-2019. Skriftlig informert samtykke er allerede innhentet fra alle pasienter for bruk og lagring av deres biologiske materiale sammen med deres godkjenning for deres deltakelse i forskningsstudier. Studien vil være i samsvar med Helsinki-erklæringen fra 1975, revidert i 1983.

Klinisk patologiske karakteristika for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen vil bli hentet fra deres journal. Diagnosen vil bli bekreftet gjennom patologirapporter, som også vil gi informasjon om grad, spredningsrate, histologisk subtype og lymfovaskulær invasjon. Fra pasientjournalen vil tumorstørrelse, nodal involvering samt metastatiske lesjoner (TNM-stadie) rapporteres. Viktigere, detaljert familiehistorie vil bli samlet inn. Innsamlingen av denne informasjonen vil være i samsvar med forskriftene til bioetiske komiteer for deltakende sykehus. Klinisk patologiske egenskaper vil være korrelert med de ulike genomiske abnormitetene identifisert ved sekvensering.

Germline DNA-ekstraksjon

Det vil bli tatt blodprøver fra pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Germline-DNA fra hvite blodceller vil bli isolert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig blod-DNA-ekstraksjonssett. Germline DNA vil deretter bli utsatt for mekanisk fragmentering via sonikering for å nå en DNA-størrelse på omtrent 200-250 bp for nedstrøms neste generasjons sekvenseringsanalyse (NGS).

Neste generasjons sekvensering

Målrettet fangstberikelse NGS er avhengig av hybridisering i løsning av DNA-biblioteker med TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) for identifisering av kimlinjemutasjoner hos kreftpasienter. Først blir TACS som retter seg mot mutasjoner assosiert med arvelig kreft (i totalt 62 kreftpredisponerende gener) designet og forberedt ved PCR etterfulgt av biotinylering. Biotinylert TACS vil deretter bli immobilisert på streptavidin-belagte magnetiske kuler for påfølgende hybridisering med DNA-bibliotekene. DNA-biblioteker er utarbeidet fra pasientavledet kimlinje-DNA som oppfyller kvalitetskontrollkriterier (DNA-utbytte, DNA-integritet og fragmentstørrelse) i henhold til etablerte protokoller. Bibliotekforberedelse involverer 3'-ende- og 5'-ende-adapterligeringen, og hvert DNA-bibliotek vil bli strekkodet ved å bruke unike oligonukleotid-DNA-sekvenser for å tillate påfølgende diskriminering etter sekvensering. Etter strekkoding vil prøvene gjennomgå hybridisering ved bruk av spesiallaget 5'-biotynylert TACS etterfulgt av PCR-amplifisering. Til slutt vil anrikede DNA-biblioteker normaliseres og slås sammen på en NGS-plattform før paret-ende-sekvensering ved bruk av produsentens protokoller.

Bioinformatikk og dataanalyse Sekvensdata fra leukocytt (buffy coat) DNA vil bli demultiplekset og justert til det menneskelige genomet (hg19) ved å bruke passende aligner-algoritmer (BWA) for å generere en BAM-fil. En kombinasjon av varianter av kallealgoritmer vil bli brukt til å kalle kimlinjemutasjoner. Lokal omjustering vil bli utført for nøyaktig deteksjon av små innsettinger og slettinger og passende algoritmer for å oppdage omorganiseringer. Bioinformatikkverktøy for kopinummerendringer (CNA-er) som ASCAT-2, CNVkit eller ANACONDA vil bli brukt for vurdering av fokale genamplifikasjons- eller delesjonshendelser. Les dybdebasert analyse vil også bli tatt i betraktning for vurdering av gen-nivå CNA. Egnede variantannotatorer vil bli brukt til å kommentere de identifiserte endringene til hvert gen. Germline-variantdatabaser som ClinVar vil bli brukt for klassifisering av varianter i henhold til ACMG-retningslinjene.