Kiembaanmutaties bij pancreasadenocarcinoom (PaMPA)

Achtergrond Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier heeft een slechte prognose, vooral benadrukt door het lage 5-jaarsoverlevingspercentage, dat wordt geschat op ongeveer 6%. Hoewel de incidentie van alvleesklierkanker in de algemene bevolking ongeveer 0,5% is, heeft het een hoog sterftecijfer. Het wordt geregistreerd als de vierde belangrijkste oorzaak van aan kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Een slechte prognose wordt voornamelijk toegeschreven aan het gebrek aan efficiënte behandelingsopties.

Aangezien de meeste gevallen van pancreasadenocarcinoom sporadisch zijn, wordt familiale clustering (gedefinieerd door de aanwezigheid van ten minste twee eerstegraads verwanten met pancreaskanker) waargenomen in ~20% van de gevallen, terwijl in ongeveer de helft van deze gevallen een duidelijke genetische oorzaak wordt geïdentificeerd. gevallen. Het is bekend dat alvleesklierkanker voorkomt bij een reeks van kankerpredisponerende syndromen, zoals erfelijke borst- en eierstokkanker, Peutz-Jeghers, familiaire adenomateuze polyposis, Lynch, Li-Fraumeni en familiale atypische meervoudige moedervleksyndromen, terwijl er duidelijke associaties met verlies zijn geweest -of-function-mutaties in niet-syndromale kankergenen, zoals PALB2 en ATM. Bovendien worden individuen die drager zijn van mutaties in het PRSS1-gen dat vatbaar is voor erfelijke pancreatitis, ook beschouwd als personen met een hoog risico op alvleesklierkanker. Het is daarom duidelijk dat alvleesklierkanker niet gerelateerd is aan een enkel kankerpredispositiegen, maar aan talrijke bekende en waarschijnlijk nog te ontdekken kankergevoeligheidsgenen.

Aan de andere kant is de juiste fractie van genetische aanleg bij alvleesklierkanker niet vastgesteld. Eerdere studies hebben de prevalentie van verlies-van-functie-mutaties in bekende genen voor kankerpredispositie bij patiënten met pancreaskanker geëvalueerd door het gebruik van multi-genpanels. De mutatieopbrengst varieerde van 3,8% tot 9,7% in genen die eerder relevant werden bevonden voor aanleg voor alvleesklierkanker.

Door deze onderzoeken is naar voren gekomen dat familiegeschiedenis en stadium van alvleesklierkanker of leeftijd bij diagnose niet altijd een voorspeller is van een onderliggende genetische factor, terwijl fenotypische heterogeniteit meestal wordt geassocieerd met mutatiestatus. De zoektocht naar nieuwe aanleggenen bij alvleesklierkankerpatiënten zonder familiegeschiedenis is aan de gang door middel van analyse van kandidaatgenen of door middel van sequentiebepaling van het hele exoom.

Onderzoeksmethodiek Klinisch-pathologische kenmerken

Genomisch DNA van alvleesklierkankerpatiënten zal retrospectief en prospectief worden verzameld bij de Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repository, tot en met de jaren 2000-2019. Van alle patiënten is al schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen voor het gebruik en de opslag van hun biologisch materiaal, samen met hun goedkeuring voor hun deelname aan onderzoeksstudies. De studie zal in overeenstemming zijn met de verklaring van Helsinki uit 1975, herzien in 1983.

Klinisch-pathologische kenmerken van patiënten met alvleesklierkanker worden uit hun medisch dossier gehaald. De diagnose zal worden bevestigd door middel van pathologierapporten, die ook informatie zullen geven over graad, proliferatiesnelheid, histologisch subtype en lymfovasculaire invasie. Uit het medisch dossier van de patiënt worden de tumorgrootte, de betrokkenheid van de knooppunten en de metastatische laesies (TNM-stadiëring) gerapporteerd. Belangrijk is dat gedetailleerde familiegeschiedenis wordt verzameld. Het verzamelen van deze informatie zal in overeenstemming zijn met de voorschriften van de bio-ethische commissies van de deelnemende ziekenhuizen. Klinisch-pathologische kenmerken zullen gecorreleerd worden met de verschillende genomische afwijkingen geïdentificeerd door sequencing.

Kiemlijn DNA-extractie

Er zullen bloedmonsters worden afgenomen van patiënten met alvleesklierkanker. Kiemlijn-DNA uit witte bloedcellen zal worden geïsoleerd met behulp van een in de handel verkrijgbare bloed-DNA-extractiekit. Kiemlijn-DNA wordt vervolgens onderworpen aan mechanische fragmentatie via sonicatie om een ​​DNA-grootte van ongeveer 200-250 bp te bereiken voor downstream next-generation sequencing (NGS)-analyse.

Sequentiebepaling van de volgende generatie

Gerichte capture-verrijking NGS vertrouwt op in-oplossing hybridisatie van DNA-bibliotheken met TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) voor de identificatie van kiembaanmutaties bij kankerpatiënten. Ten eerste worden TACS die zich richten op mutaties geassocieerd met erfelijke kanker (in een totaal van 62 kankerpredisponerende genen) ontworpen en bereid door PCR gevolgd door biotinylatie. Gebiotinyleerd TACS zal vervolgens worden geïmmobiliseerd op met streptavidine gecoate magnetische bolletjes voor daaropvolgende hybridisatie met de DNA-bibliotheken. DNA-bibliotheken worden bereid uit van de patiënt afgeleid kiemlijn-DNA dat voldoet aan de kwaliteitscontrolecriteria (DNA-opbrengst, DNA-integriteit en fragmentgrootte) volgens vastgestelde protocollen. De voorbereiding van de bibliotheek omvat de 3'-uiteinde- en 5'-uiteinde-adapterligatie en elke DNA-bibliotheek zal worden voorzien van een streepjescode met behulp van unieke oligonucleotide-DNA-sequenties om daaropvolgende discriminatie na sequentiebepaling mogelijk te maken. Na barcodering ondergaan monsters hybridisatie met behulp van op maat gemaakte 5'-gebiotynyleerde TACS gevolgd door PCR-amplificatie. Ten slotte zullen verrijkte DNA-bibliotheken worden genormaliseerd en gepoold op een NGS-platform voorafgaand aan paired-end sequencing met behulp van de protocollen van de fabrikant.

Bio-informatica en gegevensanalyse Sequentiegegevens van leukocyten (buffy coat) DNA zullen worden gedemultiplext en uitgelijnd met het menselijk genoom (hg19) met behulp van geschikte aligner-algoritmen (BWA) om een ​​BAM-bestand te genereren. Een combinatie van algoritmen voor het oproepen van varianten zal worden gebruikt om kiembaanmutaties aan te roepen. Lokale herschikking zal worden uitgevoerd voor nauwkeurige detectie van kleine toevoegingen en verwijderingen en geschikte algoritmen om herschikkingen te detecteren. Bio-informatica-tools voor het oproepen van kopienummerwijzigingen (CNA's), zoals ASCAT-2, CNVkit of ANACONDA, zullen worden gebruikt voor de beoordeling van focale genamplificatie of deletiegebeurtenissen. Op leesdiepte gebaseerde analyse zal ook in aanmerking worden genomen voor de beoordeling van CNA's op genniveau. Geschikte variantannotators zullen worden gebruikt om de geïdentificeerde wijzigingen aan elk gen te annoteren. Kiembaanvariantendatabases zoals ClinVar zullen worden gebruikt voor de classificatie van varianten volgens de ACMG-richtlijnen.