Germline mutationer i pankreatisk adenokarcinom (PaMPA)

Bakgrund Pankreatiskt ductalt adenokarcinom har dålig prognos, främst belyst av den låga 5-årsöverlevnaden, som uppskattas till cirka 6%. Även om incidensen av cancer i bukspottkörteln är cirka 0,5 % i den allmänna befolkningen, har den en hög dödlighet. Det registreras som den fjärde vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall i USA. Dålig prognos beror främst på bristen på effektiva behandlingsalternativ.

Med majoriteten av fallen av pankreasadenokarcinom som är sporadiska, observeras familjär klustring (definierad av närvaron av minst två första gradens släktingar med pankreascancer) i ~20 % av fallen, medan en tydlig genetisk orsak identifieras i ungefär hälften av dessa fall. Bukspottkörtelcancer är känd för att förekomma i en rad cancerpredisponerande syndrom, såsom ärftlig bröst- och äggstockscancer, Peutz-Jeghers, familjär adenomatös polypos, Lynch, Li-Fraumeni och familjär atypiska multipel mullvadssyndrom, medan det har funnits tydliga samband med förlust -of-function mutationer i icke-syndromiska cancergener, såsom PALB2 och ATM. Dessutom anses individer som bär mutationer i PRSS1-genen som predisponerar för ärftlig pankreatit också ha hög risk för pankreascancer. Det är därför tydligt att cancer i bukspottkörteln inte är relaterad till en enda cancerpredispositionsgen, utan med många kända och förmodligen ännu inte upptäckta cancerkänslighetsgener.

Å andra sidan har den exakta andelen av genetisk predisposition i bukspottkörtelcancer inte fastställts. Tidigare studier har utvärderat förekomsten av mutationer med förlust av funktion i kända cancerpredispositionsgener hos pankreascancerpatienter genom användning av multi-genpaneler. Mutationsutbytet varierade från 3,8 % till 9,7 % i gener som tidigare befunnits relevanta för predisposition för pankreascancer.

Genom dessa studier har det framhållits att familjehistoria och stadium av pankreascancer eller ålder vid diagnos inte alltid är en prediktor för en underliggande genetisk faktor, medan fenotypisk heterogenitet vanligtvis är förknippad med mutationsstatus. Sökandet efter nya predispositionsgener hos pankreascancerpatienter utan familjehistoria pågår genom analys av kandidatgener eller genom hel exomsekvensering.

Forskningsmetodik Klinikopatologiska egenskaper

Genomiskt DNA från pankreascancerpatienter kommer retrospektivt och prospektivt att samlas in från Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repository, under åren 2000-2019. Skriftligt informerat samtycke har redan erhållits från alla patienter för användning och lagring av deras biologiska material tillsammans med deras godkännande för deras deltagande i forskningsstudier. Studien kommer att överensstämma med 1975 års Helsingfors uttalande, reviderad 1983.

Klinikopatologiska egenskaper hos patienter med pankreascancer kommer att hämtas från deras journal. Diagnos kommer att bekräftas genom patologirapporter, som också kommer att ge information om grad, proliferationshastighet, histologisk subtyp och lymfvaskulär invasion. Från patientjournalen kommer tumörstorlek, nodal involvering samt metastaserande lesioner (TNM-stadium) att rapporteras. Viktigt är att detaljerad familjehistoria kommer att samlas in. Insamlingen av denna information kommer att ske i enlighet med bestämmelserna från bioetiska kommittéer på deltagande sjukhus. Klinikopatologiska egenskaper kommer att korreleras med de olika genomiska abnormiteter som identifieras genom sekvensering.

Germline DNA-extraktion

Blodprover kommer att samlas in från patienter med cancer i bukspottkörteln. Germline-DNA från vita blodkroppar kommer att isoleras med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt blod-DNA-extraktionskit. Germline DNA kommer sedan att utsättas för mekanisk fragmentering via sonikering för att nå en DNA-storlek på cirka 200-250 bp för nästa generations sekvenseringsanalys (NGS) nedströms.

Nästa generations sekvensering

Riktad infångningsanrikning NGS förlitar sig på hybridisering i lösning av DNA-bibliotek med TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) för identifiering av könscellsmutationer hos cancerpatienter. Först designas och prepareras TACS som riktar sig mot mutationer associerade med ärftlig cancer (i totalt 62 cancerpredisponerande gener) med PCR följt av biotinylering. Biotinylerad TACS kommer sedan att immobiliseras på streptavidinbelagda magnetiska pärlor för efterföljande hybridisering med DNA-biblioteken. DNA-bibliotek framställs från patienthärlett könslinje-DNA som uppfyller kvalitetskontrollkriterier (DNA-utbyte, DNA-integritet och fragmentstorlek) enligt etablerade protokoll. Biblioteksberedning involverar 3'-änden och 5'-ändens adapterligering och varje DNA-bibliotek kommer att streckkodas med användning av unika oligonukleotid-DNA-sekvenser för att möjliggöra efterföljande diskriminering efter sekvensering. Efter streckkodning kommer prover att genomgå hybridisering med skräddarsydd 5'-biotynylerad TACS följt av PCR-amplifiering. Slutligen kommer anrikade DNA-bibliotek att normaliseras och slås samman på en NGS-plattform före sekvensering med parad ände med hjälp av tillverkarens protokoll.

Bioinformatik och dataanalys Sekvensdata från leukocyt (buffy coat) DNA kommer att demultiplexeras och anpassas till det mänskliga genomet (hg19) med hjälp av lämpliga aligner-algoritmer (BWA) för att generera en BAM-fil. En kombination av variantanropsalgoritmer kommer att användas för att anropa könslinjemutationer. Lokal omställning kommer att utföras för noggrann detektering av små insättningar och deletioner och lämpliga algoritmer för att detektera omarrangemang. Bioinformatiska verktyg för kopienummerändringar (CNAs) som ASCAT-2, CNVkit eller ANACONDA kommer att användas för bedömning av fokal genamplifiering eller deletionshändelser. Läs djupbaserad analys kommer också att beaktas för bedömning av gennivå CNA. Lämpliga variantannotatorer kommer att användas för att kommentera de identifierade förändringarna av varje gen. Germline-variantdatabaser som ClinVar kommer att användas för klassificering av varianter enligt ACMG:s riktlinjer.