Mutazioni della linea germinale nell'adenocarcinoma pancreatico (PaMPA)

L'adenocarcinoma del dotto pancreatico ha una prognosi infausta evidenziata principalmente dal basso tasso di sopravvivenza a 5 anni, che è stimato intorno al 6%. Sebbene l'incidenza del cancro al pancreas sia di circa lo 0,5% nella popolazione generale, ha un alto tasso di mortalità. Viene registrato come la quarta principale causa di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. La prognosi sfavorevole è principalmente attribuita alla mancanza di opzioni terapeutiche efficaci.

Poiché la maggior parte dei casi di adenocarcinoma pancreatico è sporadica, si osserva clustering familiare (definito dalla presenza di almeno due parenti di primo grado con carcinoma pancreatico) in circa il 20% dei casi, mentre una chiara causa genetica è identificata in circa la metà di questi casi. È noto che il cancro al pancreas si verifica in una serie di sindromi predisponenti al cancro, come il cancro ereditario al seno e alle ovaie, Peutz-Jeghers, poliposi adenomatosa familiare, Lynch, Li-Fraumeni e sindromi familiari atipiche multiple, mentre ci sono state chiare associazioni con la perdita mutazioni di funzione nei geni del cancro non sindromico, come PALB2 e ATM. Inoltre, anche gli individui portatori di mutazioni nel gene PRSS1 che predispone alla pancreatite ereditaria sono considerati ad alto rischio di cancro al pancreas. È quindi chiaro che il cancro del pancreas non è correlato a un singolo gene di predisposizione al cancro, ma a numerosi geni di suscettibilità al cancro noti e probabilmente ancora da scoprire.

D'altra parte, la frazione precisa della predisposizione genetica nel cancro del pancreas non è stata determinata. Precedenti studi hanno valutato la prevalenza delle mutazioni con perdita di funzione nei geni noti di predisposizione al cancro nei pazienti affetti da cancro al pancreas attraverso l'uso di pannelli multigenici. La resa della mutazione variava dal 3,8% al 9,7% nei geni precedentemente trovati rilevanti per la predisposizione al cancro del pancreas.

Attraverso questi studi, è stato evidenziato che la storia familiare e lo stadio del cancro del pancreas o l'età alla diagnosi non sono sempre un fattore predittivo di un fattore genetico sottostante, mentre l'eterogeneità fenotipica è solitamente associata allo stato della mutazione. La ricerca di nuovi geni di predisposizione nei pazienti con cancro al pancreas senza storia familiare è in corso attraverso l'analisi dei geni candidati o attraverso il sequenziamento dell'intero esoma.

Metodologia della ricerca Caratteristiche clinicopatologiche

Il DNA genomico di pazienti affetti da cancro al pancreas sarà raccolto in modo retrospettivo e prospettico dal repository dei tumori dell'Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG), negli anni 2000-2019. Il consenso informato scritto è già stato ottenuto da tutti i pazienti per l'uso e la conservazione del loro materiale biologico insieme alla loro approvazione per la loro partecipazione a studi di ricerca. Lo studio sarà in accordo con la dichiarazione di Helsinki del 1975, rivista nel 1983.

Le caratteristiche clinicopatologiche dei pazienti con carcinoma pancreatico saranno recuperate dalla loro cartella clinica. La diagnosi sarà confermata attraverso referti patologici, che forniranno anche informazioni su grado, tasso di proliferazione, sottotipo istologico e invasione linfovascolare. Dalla cartella clinica del paziente verranno riportate le dimensioni del tumore, il coinvolgimento linfonodale e le lesioni metastatiche (stadiazione TNM). È importante sottolineare che verrà raccolta la storia familiare dettagliata. La raccolta di queste informazioni avverrà in conformità con i regolamenti dei comitati di bioetica degli ospedali partecipanti. Le caratteristiche clinicopatologiche saranno correlate con le diverse anomalie genomiche identificate mediante sequenziamento.

Estrazione del DNA della linea germinale

Saranno raccolti campioni di sangue da pazienti con cancro al pancreas. Il DNA della linea germinale dai globuli bianchi sarà isolato utilizzando un kit di estrazione del DNA del sangue disponibile in commercio. Il DNA della linea germinale sarà quindi sottoposto a frammentazione meccanica tramite sonicazione per raggiungere una dimensione del DNA di circa 200-250 bp per l'analisi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) a valle.

Sequenziamento di nuova generazione

Arricchimento mirato alla cattura NGS si basa sull'ibridazione in soluzione delle librerie di DNA con TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) per l'identificazione delle mutazioni germinali nei pazienti oncologici. In primo luogo, i TACS che prendono di mira le mutazioni associate al cancro ereditario (per un totale di 62 geni predisponenti al cancro) sono progettati e preparati mediante PCR seguita da biotinilazione. I TACS biotinilati saranno quindi immobilizzati su biglie magnetiche rivestite di streptavidina per la successiva ibridazione con le librerie di DNA. Le librerie di DNA sono preparate da DNA derivato dalla linea germinale del paziente che soddisfa i criteri di controllo della qualità (resa del DNA, integrità del DNA e dimensione del frammento) secondo protocolli stabiliti. La preparazione della libreria prevede la ligazione dell'adattatore dell'estremità 3' e 5' e ciascuna libreria di DNA sarà codificata a barre utilizzando sequenze di DNA oligonucleotidico univoche per consentire la successiva discriminazione dopo il sequenziamento. Successivamente al codice a barre, i campioni saranno sottoposti a ibridazione utilizzando TACS 5'-biotinilato su misura seguito da amplificazione PCR. Infine, le librerie di DNA arricchite saranno normalizzate e raggruppate su una piattaforma NGS prima del sequenziamento paired-end utilizzando i protocolli del produttore.

Bioinformatica e analisi dei dati I dati di sequenza del DNA dei leucociti (buffy coat) saranno demultiplati e allineati al genoma umano (hg19) utilizzando opportuni algoritmi di allineamento (BWA) per generare un file BAM. Verrà utilizzata una combinazione di algoritmi di identificazione delle varianti per identificare le mutazioni della linea germinale. Verrà eseguito il riallineamento locale per il rilevamento accurato di piccole inserzioni e delezioni e algoritmi appropriati per rilevare i riarrangiamenti. Strumenti bioinformatici per la chiamata di alterazioni del numero di copie (CNA) come ASCAT-2, CNVkit o ANACONDA saranno utilizzati per la valutazione di eventi di amplificazione o delezione genica focale. L'analisi basata sulla profondità di lettura sarà inoltre presa in considerazione per la valutazione dei CNA a livello di gene. Appropriati annotatori di varianti saranno utilizzati per annotare le alterazioni identificate in ciascun gene. I database delle varianti della linea germinale come ClinVar verranno utilizzati per la classificazione delle varianti secondo le linee guida ACMG.