췌장 선암종의 생식계열 돌연변이 (PaMPA)

배경 췌관 선암종은 5년 생존율이 6% 내외로 낮아 예후가 좋지 않습니다. 췌장암은 전체 인구의 약 0.5%에 불과하지만 사망률이 높은 편이다. 미국에서 암 관련 사망의 네 번째 주요 원인으로 등록되고 있습니다. 불량한 예후는 주로 효율적인 치료 옵션의 부족에 기인합니다.

대부분의 췌장 선암 사례가 산발적이기 때문에 가족 클러스터링(췌장암에 걸린 직계 가족이 2명 이상 존재하는 것으로 정의됨)이 사례의 ~20%에서 관찰되는 반면, 이 중 약 절반에서 명확한 유전적 원인이 확인됩니다. 사례. 췌장암은 유전성 유방암 및 난소암, Peutz-Jeghers, 가족성 선종성 용종증, Lynch, Li-Fraumeni 및 가족성 비정형 다발성 점 증후군과 같은 다양한 암 소인 증후군에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 손실과의 명확한 연관성이 있습니다. PALB2 및 ATM과 같은 비증후군성 암 유전자의 기능적 돌연변이. 또한 유전성 췌장염에 걸리기 쉬운 PRSS1 유전자에 돌연변이가 있는 개인도 췌장암에 걸릴 위험이 높은 것으로 간주됩니다. 따라서 췌장암이 단일 암 소인 유전자와 관련이 있는 것이 아니라 수많은 알려졌거나 아직 발견되지 않은 암 감수성 유전자와 관련되어 있음이 분명합니다.

한편, 췌장암에서 유전적 소인의 정확한 부분은 결정되지 않았습니다. 이전 연구에서는 다중 유전자 패널을 사용하여 췌장암 환자에서 알려진 암 소인 유전자의 기능 상실 돌연변이 유병률을 평가했습니다. 돌연변이 수율은 이전에 췌장암 소인과 관련된 것으로 밝혀진 유전자에서 3.8%에서 9.7% 범위였다.

이러한 연구를 통해 가족력과 췌장암의 병기 또는 진단 연령이 항상 근본적인 유전적 요인의 예측인자는 아니지만 표현형 이질성은 일반적으로 돌연변이 상태와 관련이 있다는 것이 강조되었습니다. 가족력이 없는 췌장암 환자에서 새로운 소인 유전자 탐색은 후보 유전자 분석이나 전체 엑솜 시퀀싱을 통해 진행되고 있다.

연구 방법론 임상 병리학 적 특성

췌장암 환자의 게놈 DNA는 2000년에서 2019년까지 Hellenic Cooperative Oncology Group(HeCOG) 종양 저장소에서 소급 및 전향적으로 수집됩니다. 연구 참여에 대한 승인과 함께 생물학적 물질의 사용 및 보관에 대해 모든 환자로부터 사전 서면 동의를 이미 얻었습니다. 이 연구는 1983년에 개정된 1975년 헬싱키 성명과 일치할 것입니다.

췌장암 환자의 임상병리학적 특성은 의료 기록에서 검색됩니다. 진단은 등급, 증식률, 조직학적 하위 유형 및 림프혈관 침범에 대한 정보도 제공하는 병리학 보고서를 통해 확인됩니다. 환자 의료 기록에서 종양 크기, 결절 침범 및 전이성 병변(TNM 병기)이 보고됩니다. 중요한 것은 상세한 가족 역사가 수집된다는 것입니다. 이러한 정보의 수집은 참여 병원의 생명 윤리 위원회의 규정을 준수합니다. 임상병리학적 특성은 시퀀싱에 의해 확인된 상이한 게놈 이상과 상관관계가 있을 것입니다.

생식계열 DNA 추출

췌장암 환자의 혈액 샘플을 채취합니다. 시중에서 판매되는 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 백혈구의 생식계열 DNA를 분리합니다. 그런 다음 생식선 DNA는 초음파 처리를 통해 기계적 단편화를 거쳐 다운스트림 차세대 시퀀싱(NGS) 분석을 위해 약 200-250bp의 DNA 크기에 도달합니다.

차세대 시퀀싱

표적 포획 강화 NGS는 암 환자의 생식계열 돌연변이 식별을 위해 TACS(Targeted Capture Enrichment Sequences)와 DNA 라이브러리의 용액 내 혼성화에 의존합니다. 첫째, 유전암과 관련된 돌연변이(총 62개의 암 소인 유전자)를 대상으로 하는 TACS를 설계하고 PCR에 이어 비오티닐화로 준비합니다. Biotinylated TACS는 이후 DNA 라이브러리와의 혼성화를 위해 streptavidin 코팅 자기 비드에 고정됩니다. DNA 라이브러리는 확립된 프로토콜에 따라 품질 관리 기준(DNA 수율, DNA 무결성 및 조각 크기)을 충족하는 환자 유래 생식계열 DNA에서 준비됩니다. 라이브러리 준비에는 3' 말단 및 5' 말단 어댑터 결찰이 포함되며 각 DNA 라이브러리는 고유한 올리고뉴클레오티드 DNA 서열을 사용하여 바코드가 지정되어 시퀀싱 후 후속 식별이 가능합니다. 바코딩 후 샘플은 맞춤형 5'-비오티닐화 TACS를 사용하여 혼성화한 후 PCR 증폭을 수행합니다. 마지막으로, 강화된 DNA 라이브러리는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 페어드 엔드 시퀀싱 전에 NGS 플랫폼에서 정규화되고 풀링됩니다.

BAM 파일을 생성하기 위해 적절한 정렬기 알고리즘(BWA)을 사용하여 백혈구(버피 코트) DNA의 생물 정보 및 데이터 분석 시퀀스 데이터를 역다중화하고 인간 게놈(hg19)에 정렬합니다. 변형 호출 알고리즘의 조합을 사용하여 생식계열 돌연변이를 호출합니다. 작은 삽입 및 삭제의 정확한 감지 및 재배열 감지를 위한 적절한 알고리즘을 위해 로컬 재정렬이 수행됩니다. ASCAT-2, CNVkit 또는 ANACONDA와 같은 복제 수 변경(CNA) 호출을 위한 생물 정보학 도구는 초점 유전자 증폭 또는 삭제 이벤트의 평가에 사용됩니다. 유전자 수준 CNA의 평가를 위해 읽기 깊이 기반 분석도 고려됩니다. 각 유전자에 대한 식별된 변경에 주석을 달기 위해 적절한 변이 주석자가 사용됩니다. ClinVar와 같은 생식계열 변이체 데이터베이스는 ACMG 지침에 따라 변이체를 분류하는 데 사용됩니다.