Kimlinjemutationer i bugspytkirteladenokarcinom (PaMPA)

Baggrund Pancreas duktalt adenokarcinom har dårlig prognose, hovedsageligt fremhævet af den lave 5-års overlevelsesrate, som anslås at være omkring 6%. Selvom forekomsten af ​​kræft i bugspytkirtlen er cirka 0,5 % i den generelle befolkning, har den en høj dødelighed. Det bliver registreret som den fjerde hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald i USA. Dårlig prognose tilskrives hovedsageligt manglen på effektive behandlingsmuligheder.

Da størstedelen af ​​tilfældene af bugspytkirteladenokarcinomer er sporadiske, observeres familiær clustering (defineret ved tilstedeværelsen af ​​mindst to førstegradsslægtninge med bugspytkirtelkræft) i ~20 % af tilfældene, hvorimod en klar genetisk årsag er identificeret i ca. halvdelen af ​​disse. sager. Bugspytkirtelkræft er kendt for at forekomme i en række kræftprædisponerende syndromer, såsom arvelig bryst- og ovariecancer, Peutz-Jeghers, familiær adenomatøs polypose, Lynch, Li-Fraumeni og familiære atypiske multipel mole-syndromer, mens der har været klare sammenhænge med tab -of-function mutationer i ikke-syndromiske cancergener, såsom PALB2 og ATM. Derudover anses personer, der bærer mutationer i PRSS1-genet, der disponerer for arvelig pancreatitis, også for at være i højrisiko for bugspytkirtelkræft. Det er derfor klart, at kræft i bugspytkirtlen ikke er relateret til et enkelt kræftprædispositionsgen, men med adskillige kendte og sandsynligvis endnu ikke opdagede kræftfølsomhedsgener.

På den anden side er den nøjagtige del af genetisk disposition i bugspytkirtelkræft ikke blevet bestemt. Tidligere undersøgelser har evalueret forekomsten af ​​tab af funktionsmutationer i kendte kræftprædispositionsgener hos pancreaskræftpatienter ved brug af multigenpaneler. Mutationsudbyttet varierede fra 3,8 % til 9,7 % i gener, der tidligere blev fundet relevante for prædisponering for bugspytkirtelkræft.

Gennem disse undersøgelser er det blevet fremhævet, at familiehistorie og stadium af bugspytkirtelkræft eller alder ved diagnose ikke altid er en forudsigelse for en underliggende genetisk faktor, mens fænotypisk heterogenitet normalt er forbundet med mutationsstatus. Søgningen efter nye prædisponeringsgener hos patienter med pancreascancer uden familiehistorie er i gang gennem kandidatgenanalyse eller gennem hel exome-sekventering.

Forskningsmetodik Klinisk patologiske karakteristika

Genomisk DNA fra pancreascancerpatienter vil blive indsamlet retrospektivt og prospektivt fra Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repository gennem årene 2000-2019. Der er allerede indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienter til brug og opbevaring af deres biologiske materiale sammen med deres godkendelse til deres deltagelse i forskningsstudier. Undersøgelsen vil være i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen fra 1975, revideret i 1983.

Klinisk patologiske karakteristika for patienter med bugspytkirtelkræft vil blive hentet fra deres journal. Diagnosen vil blive bekræftet gennem patologirapporter, som også vil give oplysninger om grad, proliferationshastighed, histologisk subtype og lymfovaskulær invasion. Fra patientjournalen vil tumorstørrelse, nodal involvering samt metastatiske læsioner (TNM-stadieinddeling) blive rapporteret. Det er vigtigt, at detaljeret familiehistorie vil blive indsamlet. Indsamlingen af ​​disse oplysninger vil være i overensstemmelse med reglerne fra de bioetiske komitéer på de deltagende hospitaler. Klinisk patologiske karakteristika vil blive korreleret med de forskellige genomiske abnormiteter identificeret ved sekventering.

Germline DNA ekstraktion

Blodprøver vil blive indsamlet fra patienter med bugspytkirtelkræft. Kimline-DNA fra hvide blodlegemer vil blive isoleret ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt blod-DNA-ekstraktionssæt. Germline DNA vil derefter blive udsat for mekanisk fragmentering via sonikering for at nå en DNA-størrelse på ca. 200-250 bp til nedstrøms næste generations sekventeringsanalyse (NGS).

Næste generations sekvensering

Målrettet indfangningsberigelse NGS er afhængig af hybridisering i opløsning af DNA-biblioteker med TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) til identifikation af kimlinjemutationer hos cancerpatienter. For det første designes og fremstilles TACS, der retter sig mod mutationer forbundet med arvelig cancer (i i alt 62 cancerdisponerende gener), ved PCR efterfulgt af biotinylering. Biotinyleret TACS vil derefter blive immobiliseret på streptavidin-coatede magnetiske perler til efterfølgende hybridisering med DNA-bibliotekerne. DNA-biblioteker fremstilles ud fra patientafledt kimlinje-DNA, der opfylder kvalitetskontrolkriterier (DNA-udbytte, DNA-integritet og fragmentstørrelse) i henhold til etablerede protokoller. Biblioteksforberedelse involverer 3'-ende- og 5'-ende-adapterligeringen, og hvert DNA-bibliotek vil blive stregkodet ved hjælp af unikke oligonukleotid-DNA-sekvenser for at tillade efterfølgende skelnen efter sekventering. Efter stregkodning vil prøverne gennemgå hybridisering ved hjælp af specialfremstillede 5'-biotynylerede TACS efterfulgt af PCR-amplifikation. Endelig vil berigede DNA-biblioteker blive normaliseret og samlet på en NGS-platform forud for parret ende-sekventering ved hjælp af producentens protokoller.

Bioinformatik og dataanalyse Sekvensdata fra leukocyt- (buffy coat) DNA vil blive demultiplekset og justeret til det humane genom (hg19) ved hjælp af passende aligner-algoritmer (BWA) for at generere en BAM-fil. En kombination af variant kaldende algoritmer vil blive brugt til at kalde kimlinjemutationer. Lokal realignment vil blive udført for nøjagtig detektion af små insertioner og deletioner og passende algoritmer til at detektere omarrangementer. Bioinformatiske værktøjer til kopinummerændringer (CNA'er), såsom ASCAT-2, CNVkit eller ANACONDA, vil blive brugt til vurdering af fokal genamplifikation eller deletionshændelser. Læst dybdebaseret analyse vil også blive taget i betragtning til vurdering af gen-niveau CNA'er. Passende variantannotatorer vil blive brugt til at annotere de identificerede ændringer til hvert gen. Germline-variantdatabaser såsom ClinVar vil blive brugt til klassificering af varianter i henhold til ACMG-retningslinjerne.