Mutações Germinativas em Adenocarcinoma Pancreático (PaMPA)

Antecedentes O adenocarcinoma ductal pancreático tem um mau prognóstico, principalmente evidenciado pela baixa taxa de sobrevivência aos 5 anos, estimada em cerca de 6%. Embora a incidência do câncer pancreático seja de aproximadamente 0,5% na população geral, ele tem uma alta taxa de mortalidade. Ele está sendo registrado como a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. O mau prognóstico é atribuído principalmente à falta de opções de tratamento eficientes.

Com a maioria dos casos de adenocarcinoma pancreático sendo esporádicos, o agrupamento familiar (definido pela presença de pelo menos dois parentes de primeiro grau com câncer pancreático) é observado em ~20% dos casos, enquanto uma causa genética clara é identificada em aproximadamente metade desses casos casos. Sabe-se que o câncer pancreático ocorre em uma variedade de síndromes predisponentes ao câncer, como câncer hereditário de mama e ovário, Peutz-Jeghers, polipose adenomatosa familiar, Lynch, Li-Fraumeni e síndromes familiares atípicas de mola múltipla, embora tenha havido associações claras com a perda mutações de função em genes de câncer não sindrômicos, como PALB2 e ATM. Além disso, indivíduos portadores de mutações no gene PRSS1 que predispõem à pancreatite hereditária também são considerados de alto risco para câncer de pâncreas. Portanto, é claro que o câncer pancreático não está relacionado com um único gene de predisposição ao câncer, mas com numerosos genes conhecidos e provavelmente ainda a serem descobertos, genes de suscetibilidade ao câncer.

Por outro lado, a fração exata da predisposição genética no câncer pancreático não foi determinada. Estudos anteriores avaliaram a prevalência de mutações de perda de função em genes conhecidos de predisposição ao câncer em pacientes com câncer pancreático por meio do uso de painéis multigênicos. O rendimento da mutação variou de 3,8% a 9,7% em genes que foram previamente considerados relevantes para a predisposição ao câncer pancreático.

Por meio desses estudos, foi destacado que a história familiar e o estágio do câncer de pâncreas ou a idade no momento do diagnóstico nem sempre são preditores de um fator genético subjacente, enquanto a heterogeneidade fenotípica geralmente está associada ao estado de mutação. A busca por novos genes de predisposição em pacientes com câncer pancreático sem histórico familiar está em andamento por meio da análise de genes candidatos ou do sequenciamento completo do exoma.

Metodologia de pesquisa Características clínico-patológicas

O DNA genômico de pacientes com câncer pancreático será coletado retrospectiva e prospectivamente do Repositório de Tumores do Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG), durante os anos 2000-2019. O consentimento informado por escrito já foi obtido de todos os pacientes para o uso e armazenamento de seu material biológico, juntamente com sua aprovação para sua participação em estudos de pesquisa. O estudo estará de acordo com a declaração de Helsinque de 1975, revisada em 1983.

As características clinicopatológicas dos pacientes com câncer pancreático serão recuperadas de seus registros médicos. O diagnóstico será confirmado por meio de laudos patológicos, que também fornecerão informações sobre grau, taxa de proliferação, subtipo histológico e invasão linfovascular. A partir do prontuário do paciente, serão relatados o tamanho do tumor, o envolvimento nodal, bem como as lesões metastáticas (estadiamento TNM). É importante ressaltar que o histórico familiar detalhado será coletado. A coleta dessas informações obedecerá às normas dos comitês de bioética dos hospitais participantes. As características clinicopatológicas serão correlacionadas com as diferentes anormalidades genômicas identificadas pelo sequenciamento.

Extração de DNA germinativo

Amostras de sangue serão coletadas de pacientes com câncer de pâncreas. O DNA germinativo dos glóbulos brancos será isolado usando um kit de extração de DNA sanguíneo disponível comercialmente. O DNA germinativo será então submetido à fragmentação mecânica via sonicação para atingir um tamanho de DNA de aproximadamente 200-250 pb para análise de sequenciamento de próxima geração (NGS) a jusante.

Sequenciamento de próxima geração

Enriquecimento de captura direcionada O NGS depende da hibridização em solução de bibliotecas de DNA com TACS (Sequências de enriquecimento de captura direcionada) para a identificação de mutações germinativas em pacientes com câncer. Primeiro, os TACS que visam mutações associadas ao câncer hereditário (em um total de 62 genes de predisposição ao câncer) são projetados e preparados por PCR seguido de biotinilação. TACS biotinilados serão então imobilizados em grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina para subsequente hibridização com as bibliotecas de DNA. As bibliotecas de DNA são preparadas a partir de DNA germinativo derivado de pacientes que atendem aos critérios de controle de qualidade (rendimento do DNA, integridade do DNA e tamanho do fragmento) de acordo com os protocolos estabelecidos. A preparação da biblioteca envolve a ligação do adaptador de extremidade 3' e 5' e cada biblioteca de DNA será codificada usando sequências de DNA de oligonucleotídeos únicas para permitir a discriminação subsequente após o sequenciamento. Após o código de barras, as amostras serão submetidas à hibridização usando TACS 5'-biotinilados personalizados, seguido de amplificação por PCR. Finalmente, as bibliotecas de DNA enriquecidas serão normalizadas e agrupadas em uma plataforma NGS antes do sequenciamento pareado usando os protocolos do fabricante.

Bioinformática e análise de dados Os dados de sequência do DNA de leucócitos (buffy coat) serão desmultiplexados e alinhados ao genoma humano (hg19) usando algoritmos alinhadores apropriados (BWA) para gerar um arquivo BAM. Uma combinação de algoritmos de chamada de variantes será usada para chamar mutações germinativas. Realinhamento local será realizado para detecção precisa de pequenas inserções e exclusões e algoritmos apropriados para detectar rearranjos. Ferramentas de bioinformática para chamadas de alteração do número de cópias (CNAs) como ASCAT-2, CNVkit ou ANACONDA serão utilizadas para a avaliação de eventos focais de amplificação ou deleção de genes. A análise baseada em profundidade de leitura também será levada em consideração para avaliação de CNAs em nível de gene. Anotadores de variantes apropriados serão usados ​​para anotar as alterações identificadas em cada gene. Os bancos de dados de variantes germinativas, como o ClinVar, serão usados ​​para a classificação de variantes de acordo com as diretrizes do ACMG.