膵臓腺癌における生殖細胞変異 (PaMPA)

背景 膵管腺癌の予後は不良であり、主に 5 年生存率が低く、約 6% と推定されています。 膵臓がんの発生率は一般人口で約 0.5% ですが、死亡率は高いです。 これは、米国における癌関連死の第 4 位の原因として登録されています。 予後不良の主な原因は、効率的な治療法の選択肢がないことにあります。

膵臓腺癌症例の大部分は散発性であり、家族性クラスタリング（膵臓癌の第一度近親者が少なくとも2人存在することによって定義される）が症例の約20％で観察されますが、これらの約半分で明​​確な遺伝的原因が特定されますケース。 膵臓がんは、遺伝性乳がんおよび卵巣がん、Peutz-Jeghers、家族性腺腫性ポリポーシス、リンチ、リ-フラウメニ、および家族性非定型多発奇胎症候群など、がんの素因となるさまざまな症候群で発生することが知られていますが、喪失との明確な関連性が示されています。 PALB2 や ATM などの非症候性がん遺伝子の機能異常変異。 さらに、遺伝性膵炎の素因となる PRSS1 遺伝子の変異を有する個人も、膵臓がんのリスクが高いと考えられています。 したがって、膵臓がんが単一のがん素因遺伝子と関連しているのではなく、多数の既知の、おそらくまだ発見されていないがん感受性遺伝子と関連していることは明らかです。

一方、膵臓がんの遺伝的素因の正確な割合は特定されていません。 以前の研究では、マルチ遺伝子パネルを使用して、膵臓がん患者の既知のがん素因遺伝子における機能喪失変異の有病率が評価されています。 突然変異の収率は、以前に膵臓癌の素因に関連することが判明した遺伝子で、3.8%から9.7%の範囲でした。

これらの研究を通じて、膵臓がんの家族歴とステージ、または診断時の年齢は、根底にある遺伝的要因の予測因子であるとは限らないことが強調されていますが、表現型の不均一性は通常、突然変異状態と関連しています。 家族歴のない膵臓癌患者における新規素因遺伝子の探索は、候補遺伝子解析または全エクソームシーケンシングを通じて進行中です。

研究方法論 臨床病理学的特徴

膵臓がん患者のゲノム DNA は、Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repository から 2000 年から 2019 年まで遡及的および前向きに収集されます。 書面によるインフォームド コンセントは、すべての患者から、生物学的材料の使用と保管について、調査研究への参加の承認とともに既に得られています。 この調査は、1983 年に改訂された 1975 年のヘルシンキ声明と一致しています。

膵臓がん患者の臨床病理学的特徴は、医療記録から検索されます。 診断は、グレード、増殖率、組織学的サブタイプ、およびリンパ管浸潤に関する情報も提供する病理レポートを通じて確認されます。 患者の医療記録から、腫瘍の大きさ、結節への関与、および転移性病変 (TNM 病期分類) が報告されます。 重要なことに、詳細な家族歴が収集されます。 これらの情報の収集は、参加病院の生命倫理委員会の規則に準拠します。 臨床病理学的特徴は、配列決定によって特定されたさまざまなゲノム異常と相関します。

生殖細胞系 DNA 抽出

血液サンプルは、膵臓がん患者から採取されます。 白血球からの生殖細胞系 DNA は、市販の血液 DNA 抽出キットを使用して分離されます。 生殖系列 DNA は、下流の次世代シーケンシング (NGS) 分析のために約 200 ～ 250 bp の DNA サイズに到達するために、超音波処理による機械的断片化を受けます。

次世代シーケンシング

標的捕捉濃縮 NGS は、がん患者の生殖細胞変異を同定するために、TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) を使用した DNA ライブラリーの溶液内ハイブリダイゼーションに依存しています。 まず、遺伝性がんに関連する変異 (合計 62 のがん素因遺伝子) をターゲットとする TACS を設計し、PCR とそれに続くビオチン化によって調製します。 ビオチン化されたTACSは、その後のDNAライブラリーとのハイブリダイゼーションのために、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに固定化されます。 DNA ライブラリーは、確立されたプロトコルに従って、品質管理基準 (DNA 収量、DNA の完全性、断片サイズ) を満たす患者由来の生殖細胞系 DNA から調製されます。 ライブラリーの調製には、3' 末端と 5' 末端のアダプター ライゲーションが含まれ、各 DNA ライブラリーは、独自のオリゴヌクレオチド DNA 配列を使用してバーコード化され、シーケンス後の識別が可能になります。 バーコードに続いて、カスタムメイドの 5'-ビオチン化 TACS を使用してサンプルをハイブリダイゼーションし、続いて PCR 増幅を行います。 最後に、濃縮された DNA ライブラリは正規化され、メーカーのプロトコルを使用してペアエンド シーケンスの前に NGS プラットフォームにプールされます。

バイオインフォマティクスおよびデータ分析 白血球 (バフィーコート) DNA からの配列データは逆多重化され、適切なアライナーアルゴリズム (BWA) を使用してヒトゲノム (hg19) にアラインされ、BAM ファイルが生成されます。 バリアント呼び出しアルゴリズムの組み合わせを使用して、生殖細胞変異を呼び出します。 小さな挿入と削除を正確に検出するために局所的な再編成が行われ、再編成を検出するための適切なアルゴリズムが実行されます。 ASCAT-2、CNVkit、または ANACONDA などのコピー数変更 (CNA) 呼び出し用のバイオインフォマティクス ツールは、焦点遺伝子増幅または欠失イベントの評価に使用されます。 読み取り深度ベースの分析も、遺伝子レベルの CNA の評価のために考慮されます。 適切なバリアント アノテーターを使用して、識別された各遺伝子の変化に注釈を付けます。 ClinVar などの生殖細胞バリアント データベースは、ACMG ガイドラインに従ってバリアントの分類に使用されます。