Mutations germinales dans l'adénocarcinome pancréatique (PaMPA)

Contexte L'adénocarcinome canalaire pancréatique a un mauvais pronostic principalement mis en évidence par le faible taux de survie à 5 ans, estimé à environ 6%. Bien que l'incidence du cancer du pancréas soit d'environ 0,5 % dans la population générale, son taux de mortalité est élevé. Il est enregistré comme la quatrième cause de décès liés au cancer aux États-Unis. Le mauvais pronostic est principalement attribué au manque d'options de traitement efficaces.

La majorité des cas d'adénocarcinome pancréatique étant sporadiques, un regroupement familial (défini par la présence d'au moins deux parents au premier degré atteints d'un cancer du pancréas) est observé dans environ 20 % des cas, alors qu'une cause génétique claire est identifiée dans environ la moitié de ces cas. cas. Le cancer du pancréas est connu pour se produire dans une gamme de syndromes prédisposant au cancer, tels que le cancer héréditaire du sein et de l'ovaire, Peutz-Jeghers, la polypose adénomateuse familiale, Lynch, Li-Fraumeni et les syndromes familiaux atypiques de plusieurs grains de beauté, alors qu'il existe des associations claires avec la perte mutations de fonction dans les gènes du cancer non syndromiques, tels que PALB2 et ATM. De plus, les personnes porteuses de mutations du gène PRSS1 qui prédisposent à la pancréatite héréditaire sont également considérées comme à haut risque de cancer du pancréas. Il est donc clair que le cancer du pancréas n'est pas lié à un seul gène de prédisposition au cancer, mais à de nombreux gènes de susceptibilité au cancer connus et probablement encore à découvrir.

D'autre part, la fraction précise de la prédisposition génétique au cancer du pancréas n'a pas été déterminée. Des études antérieures ont évalué la prévalence des mutations de perte de fonction dans les gènes connus de prédisposition au cancer chez les patients atteints d'un cancer du pancréas grâce à l'utilisation de panels multigéniques. Le rendement de la mutation variait de 3,8 % à 9,7 % dans les gènes précédemment jugés pertinents pour la prédisposition au cancer du pancréas.

Grâce à ces études, il a été mis en évidence que les antécédents familiaux et le stade du cancer du pancréas ou l'âge au moment du diagnostic ne sont pas toujours un facteur prédictif d'un facteur génétique sous-jacent, tandis que l'hétérogénéité phénotypique est généralement associée au statut mutationnel. La recherche de nouveaux gènes de prédisposition chez les patients atteints d'un cancer du pancréas sans antécédents familiaux est en cours grâce à l'analyse des gènes candidats ou au séquençage de l'exome entier.

Méthodologie de la recherche Caractéristiques clinicopathologiques

L'ADN génomique de patients atteints d'un cancer du pancréas sera collecté de manière rétrospective et prospective à partir du référentiel de tumeurs du Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG), au cours des années 2000-2019. Un consentement éclairé écrit a déjà été obtenu de tous les patients pour l'utilisation et le stockage de leur matériel biologique ainsi que leur approbation pour leur participation à des études de recherche. L'étude sera en accord avec la déclaration d'Helsinki de 1975, révisée en 1983.

Les caractéristiques clinicopathologiques des patients atteints d'un cancer du pancréas seront extraites de leur dossier médical. Le diagnostic sera confirmé par des rapports de pathologie, qui fourniront également des informations sur le grade, le taux de prolifération, le sous-type histologique et l'invasion lymphovasculaire. À partir du dossier médical du patient, la taille de la tumeur, l'envahissement ganglionnaire ainsi que les lésions métastatiques (stade TNM) seront rapportés. Il est important de noter que des antécédents familiaux détaillés seront recueillis. La collecte de ces informations sera conforme aux règlements des comités de bioéthique des hôpitaux participants. Les caractéristiques clinicopathologiques seront corrélées aux différentes anomalies génomiques identifiées par séquençage.

Extraction d'ADN germinal

Des échantillons de sang seront prélevés sur des patients atteints d'un cancer du pancréas. L'ADN germinal des globules blancs sera isolé à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN sanguin disponible dans le commerce. L'ADN de la lignée germinale sera ensuite soumis à une fragmentation mécanique par sonication pour atteindre une taille d'ADN d'environ 200 à 250 pb pour une analyse de séquençage de nouvelle génération (NGS) en aval.

Séquençage de nouvelle génération

Enrichissement par capture ciblée NGS s'appuie sur l'hybridation en solution de bibliothèques d'ADN avec des TACS (Séquences d'enrichissement par capture ciblée) pour l'identification des mutations germinales chez les patients cancéreux. Premièrement, les TACS qui ciblent les mutations associées au cancer héréditaire (dans un total de 62 gènes prédisposant au cancer) sont conçus et préparés par PCR suivie d'une biotinylation. Les TACS biotinylés seront ensuite immobilisés sur des billes magnétiques revêtues de streptavidine pour une hybridation ultérieure avec les bibliothèques d'ADN. Les bibliothèques d'ADN sont préparées à partir d'ADN de lignée germinale dérivée de patients qui répondent aux critères de contrôle de qualité (rendement d'ADN, intégrité de l'ADN et taille des fragments) selon des protocoles établis. La préparation de la bibliothèque implique la ligature de l'adaptateur d'extrémité 3' et 5' et chaque bibliothèque d'ADN sera codée à l'aide de séquences d'ADN oligonucléotidiques uniques pour permettre une discrimination ultérieure après le séquençage. Après le codage à barres, les échantillons subiront une hybridation à l'aide de TACS 5'-biotynylés personnalisés, suivis d'une amplification par PCR. Enfin, les bibliothèques d'ADN enrichies seront normalisées et regroupées sur une plate-forme NGS avant le séquençage apparié à l'aide des protocoles du fabricant.

Bioinformatique et analyse des données Les données de séquence de l'ADN des leucocytes (buffy coat) seront démultiplexées et alignées sur le génome humain (hg19) à l'aide d'algorithmes d'alignement appropriés (BWA) pour générer un fichier BAM. Une combinaison d'algorithmes d'appel de variantes sera utilisée pour appeler les mutations germinales. Un réalignement local sera effectué pour une détection précise des petites insertions et suppressions et des algorithmes appropriés pour détecter les réarrangements. Des outils bioinformatiques pour les altérations du nombre de copies (CNA) tels que ASCAT-2, CNVkit ou ANACONDA seront utilisés pour l'évaluation des événements d'amplification ou de délétion de gènes focaux. L'analyse basée sur la profondeur de lecture sera également prise en compte pour l'évaluation des CNA au niveau des gènes. Des annotateurs de variants appropriés seront utilisés pour annoter les altérations identifiées de chaque gène. Des bases de données de variantes germinales telles que ClinVar seront utilisées pour la classification des variantes selon les directives de l'ACMG.