Csíravonal-mutációk hasnyálmirigy-adenokarcinómában (PaMPA)

Háttér A hasnyálmirigy ductalis adenokarcinóma rossz prognózisú, amit főként az alacsony 5 éves túlélési arány emel ki, amely a becslések szerint körülbelül 6%. Bár a hasnyálmirigyrák előfordulási aránya az általános populációban körülbelül 0,5%, a halálozási arány magas. Az Egyesült Államokban a rákkal összefüggő halálozások negyedik vezető okaként tartják nyilván. A rossz prognózis főként a hatékony kezelési lehetőségek hiányának tudható be.

Mivel a hasnyálmirigy-adenokarcinómás esetek többsége szórványos, az esetek ~20%-ában családi csoportosulás figyelhető meg (amelyet legalább két elsőfokú hasnyálmirigyrákos rokon jelenléte határoz meg), míg az esetek körülbelül felében egyértelmű genetikai okot azonosítanak. esetek. Ismeretes, hogy a hasnyálmirigyrák számos rákra hajlamosító tünetegyüttesben fordul elő, mint például az örökletes emlő- és petefészekrák, Peutz-Jeghers, familiáris adenomatózus polipózis, Lynch, Li-Fraumeni és familiáris atipikus több anyajegy szindróma, miközben egyértelmű összefüggések vannak a veszteséggel funkciós mutációk a nem szindrómás rákgénekben, mint például a PALB2 és az ATM. Ezenkívül az örökletes hasnyálmirigy-gyulladásra hajlamosító PRSS1 gén mutációit hordozó egyéneket szintén magas kockázatnak tekintik a hasnyálmirigyrákra. Nyilvánvaló tehát, hogy a hasnyálmirigyrák nem egyetlen rákra hajlamosító génnel áll kapcsolatban, hanem számos ismert és valószínűleg még felfedezésre váró rákérzékenységi génnel.

Másrészt a hasnyálmirigyrák genetikai hajlamának pontos hányadát nem határozták meg. Korábbi tanulmányok több génből álló panelek segítségével értékelték a funkcióvesztési mutációk prevalenciáját az ismert rákra hajlamos génekben hasnyálmirigyrákos betegeknél. A mutációs hozam 3,8% és 9,7% között volt azokban a génekben, amelyekről korábban azt találták, hogy relevánsak a hasnyálmirigyrákra való hajlam szempontjából.

Ezek a tanulmányok rávilágítottak arra, hogy a hasnyálmirigyrák családi anamnézisében és stádiumában vagy a diagnóziskor fennálló életkorban nem mindig lehet előrejelezni a mögöttes genetikai faktort, míg a fenotípusos heterogenitás általában a mutációs státuszhoz kapcsolódik. Az új hajlamgének keresése olyan hasnyálmirigyrákos betegeknél, akiknél nem szerepel családi anamnézis, a jelölt gének elemzése vagy a teljes exome szekvenálás révén folyamatban van.

Kutatási módszertan Klinikapatológiai jellemzők

A hasnyálmirigyrákos betegek genomiális DNS-ét a Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) Tumor Repositoryjából 2000 és 2019 között retrospektíven és prospektíven gyűjtik össze. Már minden beteg írásos beleegyezését szerezte be biológiai anyagának felhasználásához és tárolásához, valamint jóváhagyta a kutatási vizsgálatokban való részvételét. A tanulmány összhangban lesz az 1983-ban felülvizsgált 1975-ös Helsinki nyilatkozattal.

A hasnyálmirigyrákos betegek klinikopatológiai jellemzőit a kórlapjukból lekérik. A diagnózist patológiai jelentések erősítik meg, amelyek a fokozatról, a proliferációs rátáról, a szövettani altípusról és a limfovaszkuláris invázióról is tájékoztatást adnak. A beteg kórlapjából a daganat méretét, a csomópont érintettségét, valamint a metasztatikus elváltozásokat (TNM stádium) jelentik. Fontos, hogy részletes családtörténetet gyűjtenek. Ezen információk gyűjtése a részt vevő kórházak bioetikai bizottságainak előírásai szerint történik. A klinikopatológiai jellemzők összefüggést mutatnak a szekvenálás által azonosított különböző genomiális rendellenességekkel.

Csíravonal DNS-kivonás

Vérmintákat vesznek a hasnyálmirigyrákos betegektől. A fehérvérsejtekből származó csíravonal-DNS-t a kereskedelemben kapható vér-DNS extrakciós készlet segítségével izolálják. A csíravonal DNS-ét ezután ultrahangos kezeléssel mechanikus fragmentációnak vetik alá, hogy elérjék a körülbelül 200-250 bp DNS-méretet a downstream következő generációs szekvenálás (NGS) elemzéséhez.

Következő generációs szekvenálás

A célzott befogás dúsítása Az NGS a DNS-könyvtárak és a TACS (Targeted Capture Enrichment Sequences) oldaton belüli hibridizációján alapul a rákos betegek csíravonal-mutációinak azonosítása érdekében. Először is, az örökletes rákkal kapcsolatos mutációkat célzó TACS-t (összesen 62 rákra hajlamosító génben) PCR-rel, majd biotinilációval készítik el. A biotinilált TACS-t ezután sztreptavidinnel bevont mágneses gyöngyökön immobilizálják a későbbi hibridizációhoz a DNS-könyvtárakkal. A páciensből származó csíravonal DNS-ből DNS-könyvtárakat készítenek, amelyek megfelelnek a minőség-ellenőrzési kritériumoknak (DNS-hozam, DNS-integritás és fragmentumméret) a megállapított protokollok szerint. A könyvtár előkészítése magában foglalja a 3'-vég és az 5'-vég adapter ligálását, és minden DNS-könyvtárat egyedi oligonukleotid-DNS-szekvenciák használatával vonalkódolunk, hogy lehetővé tegyük a szekvenálás utáni megkülönböztetést. A vonalkódolást követően a minták hibridizáción mennek keresztül egyedi gyártású 5'-biotinilezett TACS-sel, majd PCR-amplifikációval. Végül a dúsított DNS-könyvtárakat normalizálják és egyesítik egy NGS-platformon a páros végű szekvenálás előtt a gyártó protokollja szerint.

Bioinformatikai és adatelemzés A leukocita (buffy coat) DNS-ből származó szekvenciaadatokat demultiplexeljük és a humán genomhoz (hg19) igazítjuk megfelelő igazító algoritmusok (BWA) segítségével BAM-fájl létrehozásához. Változathívó algoritmusok kombinációját fogják használni a csíravonal-mutációk hívására. Helyi átrendezést hajtanak végre a kis beszúrások és törlések pontos észlelése érdekében, és megfelelő algoritmusokat alkalmaznak az átrendeződések észlelésére. A kópiaszám-módosításokat (CNA-kat) hívó bioinformatikai eszközöket, például az ASCAT-2-t, a CNVkit-et vagy az ANACONDA-t használják a fokális génamplifikációs vagy -deléciós események értékelésére. A génszintű CNS-ek értékelésénél figyelembe kell venni az olvasási mélység alapú elemzést is. Megfelelő variáns annotátorokat használunk az egyes génekben azonosított változások megjegyzésére. A csíravonal-változatok adatbázisait, például a ClinVar-t, a változatok ACMG-irányelvek szerinti osztályozására fogják használni.