Мутации зародышевой линии при аденокарциноме поджелудочной железы (PaMPA)

Актуальность темы Аденокарцинома протоков поджелудочной железы имеет неблагоприятный прогноз, в основном из-за низкой 5-летней выживаемости, которая, по оценкам, составляет около 6%. Хотя заболеваемость раком поджелудочной железы составляет примерно 0,5% в общей популяции, он имеет высокий уровень смертности. Он регистрируется как четвертая основная причина смерти от рака в Соединенных Штатах. Плохой прогноз в основном связан с отсутствием эффективных вариантов лечения.

Поскольку большинство случаев аденокарциномы поджелудочной железы являются спорадическими, семейная кластеризация (определяемая наличием как минимум двух родственников первой степени родства с раком поджелудочной железы) наблюдается примерно в 20% случаев, тогда как четкая генетическая причина идентифицируется примерно в половине этих случаев. случаи. Известно, что рак поджелудочной железы встречается при ряде предрасполагающих к раку синдромов, таких как наследственный рак груди и яичников, синдром Пейтца-Егерса, семейный аденоматозный полипоз, синдромы Линча, Ли-Фраумени и семейные атипичные синдромы множественных родинок, в то время как были выявлены четкие ассоциации с потерей функциональные мутации в генах несиндромального рака, таких как PALB2 и ATM. Кроме того, люди, несущие мутации в гене PRSS1, которые предрасполагают к наследственному панкреатиту, также считаются подверженными высокому риску рака поджелудочной железы. Поэтому ясно, что рак поджелудочной железы связан не с одним геном предрасположенности к раку, а с многочисленными известными и, вероятно, еще не открытыми генами предрасположенности к раку.

С другой стороны, точная доля генетической предрасположенности к раку поджелудочной железы не определена. Предыдущие исследования оценивали распространенность мутаций потери функции в известных генах предрасположенности к раку у пациентов с раком поджелудочной железы с использованием мультигенных панелей. Выход мутаций варьировался от 3,8% до 9,7% в генах, которые ранее были признаны связанными с предрасположенностью к раку поджелудочной железы.

Благодаря этим исследованиям было подчеркнуто, что семейный анамнез и стадия рака поджелудочной железы или возраст на момент постановки диагноза не всегда являются предикторами лежащего в основе генетического фактора, в то время как фенотипическая гетерогенность обычно связана с мутационным статусом. Поиск новых генов предрасположенности у пациентов с раком поджелудочной железы без семейного анамнеза продолжается посредством анализа генов-кандидатов или путем секвенирования всего экзома.

Методология исследования Клинико-патологическая характеристика

Геномная ДНК пациентов с раком поджелудочной железы будет ретроспективно и проспективно собрана из репозитория опухолей Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) в течение 2000–2019 годов. От всех пациентов уже получено письменное информированное согласие на использование и хранение их биологического материала, а также одобрение их участия в научных исследованиях. Исследование будет согласовываться с Хельсинкским заявлением 1975 года, пересмотренным в 1983 году.

Клинико-патологические характеристики пациентов с раком поджелудочной железы будут извлечены из их медицинских карт. Диагноз будет подтвержден отчетами о патологии, которые также предоставят информацию о степени, скорости пролиферации, гистологическом подтипе и лимфоваскулярной инвазии. Из медицинской карты пациента будет сообщено о размере опухоли, поражении узлов, а также о метастатических поражениях (стадия TNM). Важно, чтобы был собран подробный семейный анамнез. Сбор этой информации будет осуществляться в соответствии с положениями комитетов по биоэтике участвующих больниц. Клиникопатологические характеристики будут коррелировать с различными геномными аномалиями, выявленными с помощью секвенирования.

Экстракция ДНК зародышевой линии

Образцы крови будут взяты у пациентов с раком поджелудочной железы. ДНК зародышевой линии из лейкоцитов будет выделена с использованием имеющегося в продаже набора для выделения ДНК крови. Затем ДНК зародышевой линии будет подвергнута механической фрагментации с помощью ультразвука для достижения размера ДНК примерно 200-250 п.н. для последующего анализа секвенирования следующего поколения (NGS).

Секвенирование следующего поколения

Целевое обогащение захвата NGS основано на гибридизации в растворе библиотек ДНК с TACS (целевыми последовательностями обогащения захвата) для идентификации мутаций зародышевой линии у больных раком. Во-первых, TACS, нацеленные на мутации, связанные с наследственным раком (всего 62 предрасполагающих к раку гена), разрабатываются и получаются с помощью ПЦР с последующим биотинилированием. Затем биотинилированные TACS иммобилизуют на магнитных шариках, покрытых стрептавидином, для последующей гибридизации с библиотеками ДНК. Библиотеки ДНК готовят из ДНК зародышевой линии пациента, которые соответствуют критериям контроля качества (выход ДНК, целостность ДНК и размер фрагмента) в соответствии с установленными протоколами. Подготовка библиотеки включает лигирование 3'-конца и 5'-конца адаптера, и каждая библиотека ДНК будет штрих-кодирована с использованием уникальных последовательностей олигонуклеотидов ДНК, чтобы обеспечить последующее различение после секвенирования. После штрих-кодирования образцы будут подвергаться гибридизации с использованием изготовленного на заказ 5'-биотинилированного TACS с последующей ПЦР-амплификацией. Наконец, обогащенные библиотеки ДНК будут нормализованы и объединены на платформе NGS перед секвенированием парных концов с использованием протоколов производителя.

Биоинформатика и анализ данных Данные последовательности ДНК лейкоцитов (лейкоцитарной пленки) будут демультиплексированы и сопоставлены с геномом человека (hg19) с использованием соответствующих алгоритмов выравнивания (BWA) для создания файла BAM. Комбинация алгоритмов вызова вариантов будет использоваться для вызова мутаций зародышевой линии. Локальная перестройка будет выполняться для точного обнаружения небольших вставок и делеций и соответствующих алгоритмов для обнаружения перестановок. Инструменты биоинформатики для вызова изменений числа копий (CNA), такие как ASCAT-2, CNVkit или ANACONDA, будут использоваться для оценки событий амплификации или делеции фокального гена. Анализ на основе глубины чтения также будет учитываться для оценки CNA на уровне генов. Соответствующие аннотаторы вариантов будут использоваться для аннотирования выявленных изменений каждого гена. Базы данных вариантов зародышевой линии, такие как ClinVar, будут использоваться для классификации вариантов в соответствии с рекомендациями ACMG.