Délka telomer ve vztahu k akutní stresové reakci u pacientů s kritickou péčí

Analýza délky telomer byla stanovena ze 2 vzorků krve, první vzorek byl odebrán v prvních 72 hodinách po hospitalizaci a druhý po méně než 5 nebo > 14 dnech. U pacientů propuštěných před 5. dnem byl odebrán a analyzován opakovaný vzorek v den propuštění. Zpracování vzorku krve bylo následující: bylo odebráno 5 ml krve a červené krvinky (RBC) byly lyžovány pomocí roztoku pro lýzu RBC (Biological Industries, Beit Haemek, Izrael). Izolace genomové DNA byla provedena pomocí DNA izolačního kitu pro savčí krev (Roche, Mannheim, Německo). Stručně, DNA byla izolována postupem vysolování, promyta a vysrážena isopropanolem. DNA byla resuspendována ve vodě stupně pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Koncentrace DNA byla měřena pomocí zařízení NanoDrop (Thermo Fisher, USA).

Vzorky DNA byly analyzovány na délku telomer podle metody Cawthona (2009) [20] s mírnými úpravami. Každý vzorek DNA byl analyzován dvěma sadami primerů podrobně popsanými níže, jedním pro analýzu délky telomer a jedním pro analýzu referenčního genu (lidský hemoglobin). Primery byly zředěny na 100 uM ve vodě čistoty pro PCR a poté na 10 uM. Vzorky DNA byly zředěny na 2,5 ng/ul ve vodě stupně PCR. Sekvence primerů jsou uvedeny níže:

telc: TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA telg: ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT hbgd:_GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGGAGGAGAAGTCTGCCGGGGCTGCGGGGGCGCTGGGGGGC CCACGTTCACCTTG

Reakční PCR byly zpracovány následovně:

50 °C po dobu 2 minut, 95 °C po dobu 5 minut, jeden cyklus 94 °C po dobu 15 sekund, 49 °C po dobu 15 sekund; 40 cyklů: 94 °C po dobu 15 sekund, 62 °C po dobu 10 sekund a konečná fáze: 74 °C po dobu 15 sekund. Všechny reakce byly provedeny pomocí zařízení Step One (ABI, USA).